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以
STO
细胞和
hELF
作为胚胎生殖细胞培养饲
养层的比较
作者:刘永刚,李芳菲,陈地龙,王莎莉,王亚平
【关键词】
STO
细胞;胚胎肺成纤维细胞;胚胎生殖细胞;人类
Comparison
between STO cells and hELF used as feeder
layers of embryonic germ cells
【
Abs
tract
】
AIM:
To
compare
the
influence
on
the
growth
of human embryonic
germ (EG) cells by SIM mouse embryoderived
thioguanine
and
ouabain
resistant
(STO)
cells
and
human
embryonic
lung
fibroblasts
(
hELF
)
respectively
as
feeder
layers
and
the
changes
of
the
two
kinds
of
the
feeder
layers
themselves
processed with
mitomycin C. METHODS: We isolated and cultured
hELF of 3-4 month embryos. The changes
of the two kinds of the
feeder
layers
themselves
treated
with
mitomycin
C
were
observed.
STO
and
hELFs
erved
as
feeder
layer
to
cultivate
human
EG
formation rate of
embryonic germ cell colony and the
expression
of
EG
cell
surface
markers(SSEA1,
SSEA4)
expression
were
detected.
to
discuss
the
influence
on
human
EG
cell
growth.
RESULTS: HELF
treated by mitomycin C survived longer than STO
cells
treated
by
mitomycin
C
did.
There
was
no
obvious
difference
between
the
two
kinds
of
feeder
layers
in
the
formation
rate
and
immunologic
markers
(SSEA1,
SSEA4)
of
EG
cell
colony.
CONCLUSION:
1
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HELF as feeder layers is better than
STO cells in culturing EG
cells.
【
Key
words
】
STO cells; embryonic
lung fibroblasts;
embryonic germ cells;
humans
【摘要】
目的:
比较以
STO
细胞和人胚胎肺成纤维细胞
(hELF)
作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞
(EG)
生长的影响
以及经丝裂酶素
C
处
理后的两种饲养层
的变化
.
方法:
分离、培养
3~4
mo
hELF
,观察经
丝裂酶素
C
处理
STO
细胞和
hELF
后形态学变化,以
STO
细胞和
hELF
作为饲养层培养人
EG
细胞,计数
EG
细胞集落的形成率
以及免疫组化
检测
EG
细胞表面标志物
抗阶段特异性胚胎抗原
1(SSEA1)
和抗阶段特
异性胚胎抗原
4(SSEA4).
结果:
经丝裂霉素
< br>C
处理后
hELF
较
STO
细
胞生存时间明显长,
形态维持更好;
以
hELF
和
p>
STO
细胞作为饲养层培
养人
EG
细胞,
集落形成率没有明显差异;
两种饲养层上形成的集落免
疫学特征无明显差异
.
结论:
在培养人
EG
细胞时,
hELF
饲养层较<
/p>
STO
细胞饲养层更有优势
.
【关键词】
STO
细胞;胚胎肺成纤
维细胞;胚胎生殖细胞;
人类
0
引言
自
199
8
年
Thomason
等
[
1
]
首次建立人胚胎干细
胞
(embryonic
stem
cell,
ES)
系和
Shamblott
等
[
2
]
建立人胚胎生殖细胞
(embryo
nic
germ cell, EG)
系以来,胚胎性干细胞
研究已成为当今生命科学领域
内的热门课题
.
胚胎性干细胞作为组织工程的种子细胞,将为细胞、
2
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组织甚至器官替代治疗提供无限细胞来源,也将为临床治疗模式带来
革命性变革
[
3
]
.
谢松涛等
[
4
]
也对人胚胎生殖嵴来源的人
EG
细胞
进行了培养,
但迄今为止,
来源于人胚胎生殖嵴的
EG
细胞系仅有一例
报道
.
有学者认为
STO
细胞
在建立人
EG
细胞系过程中具有不可替代的
作用
.
由于
STO
细胞是来源于鼠的成纤维细胞系,
用
STO
细胞作为饲
养层将会给临床应用带来潜在的危险
.
我们用
STO
细胞和人胚胎肺成
纤维细胞(
human
embryonic
lung
fibroblast,
hELF
)
作为饲养层培
养人
EG
细胞,旨在探讨
两种饲养层经丝裂酶素
C
处理后的变化和对
EG
细胞生长的影响
.
1
材料和方法
1.1
材
料高糖
DMEM
培养基(
Dulbec
cos modified Eagles
medium, DMEM
)购自
GIBICO
公司;
无钙镁磷酸缓冲液
(Dulbeccos
phosphate buffered saline, DPBS)
、非必需氨基酸、二甲基亚砜、
优质胎牛血清购自
Hy
clone
公司;胰蛋白酶、
β
巯基乙
醇、毛喉素
(
Forskolin
)购
自
Sigma
公司;丝裂霉素
C
购自
Kyowa
Hakko
Kogyo
公司;
胶原酶购自上海桥源生物制
药公司;
DNA
酶Ⅰ购自
Roche
公司;
人
重
组
碱
性
成
p>
纤
维
细
胞
生
长
因
子
(human
recombinant
basic
fibroblast growth
factor, hrbFGF)
购自
Pepro Tech
EC
公司;人
重
组
白
血
病
抑
制
因
子
(human
recombinant
leukemia
inhibitory
factor,
hrLIF)
购
自
CHEMICO
N
公
司
;
抗<
/p>
阶
段
特
异
性
胚
胎
抗
原
1(SSEA1)mAb
和抗阶段特异性胚胎抗
原
4(SSEA4)mAb
由美国芝加哥大
学
Dr.
Bruce
Lahn
提供;
UltrasenstinveTM
SP
试剂盒购自迈新公司;
3
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DAB
显色试剂盒购自中山公司;
6
~
11 wk
人工流产胚胎(重庆医科大
学第二临床学院人流室同意提供)用于分离人
EG
细胞;
3
~
4
mo
胚胎
用于制备
hELF
;
STO
细胞由本室保存
.
1.2
方法
mo
人工流产胚胎肺组织,按照薛
庆善等的方法分离获取
hELF
,
常规
方法培养传代,
经反复传代获得纯化的
hELF.
取对数生长
期
hELF
,
用终浓度为
12.5
μ
g/mL
p>
丝裂霉素
C
处理
2
.5
~
3 h
;
DPBS
洗
3
次;
< br> 2.5 g/L
胰酶消化
2 min
< br>;
DPBS
洗
3
次;以细胞浓度为
2
×
105
/mL
种植在
1
g/L
明胶处理后的
24
孔培养板中,
每孔
1
mL
;
< br>置
37
℃,
95%
湿度和
50 mL/L
CO2
恒温细胞培养箱中培养,
4 h
后吸去培养液和
尚未贴壁的细胞,换入等量培养液,置培养箱中备用,
< br>1
wk
内均可使
用
.
,用终浓度为
10
μ
g/mL
丝裂霉素
C
按上述方
法处理备用
.
wk
胚胎生殖嵴用
DPBS
冲洗
3
次;
400
U/mL
的胶原酶
0.5
mL,
37
℃下消化
45
< br>min
;
灭菌加样枪反复吹吸,
将生殖嵴离散为小细胞团;
1
g/L
的胰蛋白酶和
0.2 g/L EDTA
溶液,
37
℃下消化
5
min
;加入等
体积含
100
mL/L
胎牛血清的培养液终止反应;加入
2
00
U
的
Dnase
Ⅰ
作用
10 min
;轻柔吹
打使细胞分离,胚胎干细胞培养液重悬后以
1
×
105,
1
×
10,
p>
1
×
103/mL
三种浓度种植于
STO
细胞和
hELF
细胞饲养层,
胚胎干细胞培养液包含
8
00 mL/L
高糖
DMEM, 200
mL/L
胎牛血清
,2
mmol/L
L
谷胺酰氨
,0.1
mmol/L
非必需氨基酸
,0.1 mmol/L
2
巯基乙
醇
,10
μ
mol/L
Forskolin,
2
μ
g/mL
hrbFGF,
LIF
10
×
105
IU/L,
10
4
页