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以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较

作者:高考题库网
来源:https://www.bjmy2z.cn/gaokao
2021-02-08 07:21
tags:

-

2021年2月8日发(作者:prilosec)


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STO


细胞和


hELF


作为胚胎生殖细胞培养饲


养层的比较




作者:刘永刚,李芳菲,陈地龙,王莎莉,王亚平



【关键词】


STO


细胞;胚胎肺成纤维细胞;胚胎生殖细胞;人类





Comparison between STO cells and hELF used as feeder


layers of embryonic germ cells





Abs tract



AIM:


To


compare


the


influence


on


the


growth


of human embryonic germ (EG) cells by SIM mouse embryoderived


thioguanine


and


ouabain


resistant


(STO)


cells


and


human


embryonic


lung


fibroblasts



hELF



respectively


as


feeder


layers


and


the


changes


of


the


two


kinds


of


the


feeder


layers


themselves


processed with mitomycin C. METHODS: We isolated and cultured


hELF of 3-4 month embryos. The changes of the two kinds of the


feeder


layers


themselves


treated


with


mitomycin


C


were


observed.


STO


and


hELFs


erved


as


feeder


layer


to


cultivate


human


EG


formation rate of embryonic germ cell colony and the


expression


of


EG


cell


surface


markers(SSEA1,


SSEA4)


expression


were


detected.


to


discuss


the


influence


on


human


EG


cell


growth.


RESULTS: HELF treated by mitomycin C survived longer than STO


cells


treated


by


mitomycin


C


did.


There


was


no


obvious


difference


between


the


two


kinds


of


feeder


layers


in


the


formation


rate


and


immunologic


markers


(SSEA1,


SSEA4)


of


EG


cell


colony.


CONCLUSION:


1




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HELF as feeder layers is better than STO cells in culturing EG


cells.





Key words



STO cells; embryonic lung fibroblasts;


embryonic germ cells; humans




【摘要】



目的:



比较以


STO


细胞和人胚胎肺成纤维细胞


(hELF)


作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞


(EG)


生长的影响 以及经丝裂酶素


C



理后的两种饲养层 的变化


.


方法:



分离、培养


3~4


mo

< p>
hELF


,观察经


丝裂酶素


C


处理


STO


细胞和


hELF


后形态学变化,以


STO

细胞和


hELF


作为饲养层培养人


EG


细胞,计数


EG


细胞集落的形成率 以及免疫组化


检测


EG


细胞表面标志物 抗阶段特异性胚胎抗原


1(SSEA1)


和抗阶段特

< p>
异性胚胎抗原


4(SSEA4).


结果:



经丝裂霉素

< br>C


处理后


hELF


< p>
STO



胞生存时间明显长,

形态维持更好;



hELF



STO


细胞作为饲养层培


养人


EG


细胞,


集落形成率没有明显差异;


两种饲养层上形成的集落免


疫学特征无明显差异


.


结论:



在培养人

EG


细胞时,


hELF


饲养层较< /p>


STO


细胞饲养层更有优势


.




【关键词】


STO


细胞;胚胎肺成纤 维细胞;胚胎生殖细胞;


人类





0


引言






199 8



Thomason




1



首次建立人胚胎干细 胞


(embryonic


stem


cell,


ES)


系和


Shamblott




2



建立人胚胎生殖细胞


(embryo nic


germ cell, EG)


系以来,胚胎性干细胞 研究已成为当今生命科学领域


内的热门课题


.


胚胎性干细胞作为组织工程的种子细胞,将为细胞、


2




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组织甚至器官替代治疗提供无限细胞来源,也将为临床治疗模式带来


革命性变革



3



.

< p>
谢松涛等



4



也对人胚胎生殖嵴来源的人


EG


细胞

< p>
进行了培养,


但迄今为止,


来源于人胚胎生殖嵴的


EG


细胞系仅有一例


报道


.


有学者认为


STO


细胞 在建立人


EG


细胞系过程中具有不可替代的

作用


.


由于


STO

< p>
细胞是来源于鼠的成纤维细胞系,



STO


细胞作为饲


养层将会给临床应用带来潜在的危险


.


我们用


STO


细胞和人胚胎肺成


纤维细胞(


human


embryonic


lung


fibroblast,


hELF


) 作为饲养层培


养人


EG


细胞,旨在探讨 两种饲养层经丝裂酶素


C


处理后的变化和对

EG


细胞生长的影响


.




1


材料和方法





1.1


材 料高糖


DMEM


培养基(


Dulbec cos modified Eagles


medium, DMEM


)购自


GIBICO


公司;



无钙镁磷酸缓冲液


(Dulbeccos


phosphate buffered saline, DPBS)


、非必需氨基酸、二甲基亚砜、


优质胎牛血清购自


Hy clone


公司;胰蛋白酶、


β


巯基乙 醇、毛喉素



Forskolin


)购 自


Sigma


公司;丝裂霉素


C


购自


Kyowa


Hakko


Kogyo


公司;


胶原酶购自上海桥源生物制 药公司;


DNA


酶Ⅰ购自


Roche


公司;


















(human


recombinant


basic


fibroblast growth factor, hrbFGF)


购自


Pepro Tech EC


公司;人










(human


recombinant


leukemia


inhibitory


factor,

hrLIF)




CHEMICO N





抗< /p>









< p>


1(SSEA1)mAb


和抗阶段特异性胚胎抗 原


4(SSEA4)mAb


由美国芝加哥大


Dr.


Bruce


Lahn


提供;


UltrasenstinveTM


SP


试剂盒购自迈新公司;



3




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DAB


显色试剂盒购自中山公司;


6



11 wk


人工流产胚胎(重庆医科大


学第二临床学院人流室同意提供)用于分离人


EG


细胞;


3



4


mo


胚胎


用于制备


hELF



STO


细胞由本室保存


.




1.2


方法





mo


人工流产胚胎肺组织,按照薛 庆善等的方法分离获取


hELF



常规 方法培养传代,


经反复传代获得纯化的


hELF.

< p>
取对数生长



hELF


, 用终浓度为


12.5


μ


g/mL


丝裂霉素


C


处理


2 .5



3 h



DPBS



3


次;

< br> 2.5 g/L


胰酶消化


2 min

< br>;


DPBS



3


次;以细胞浓度为


2


×


105 /mL


种植在


1


g/L


明胶处理后的


24


孔培养板中,

每孔


1


mL


< br>置


37


℃,


95%


湿度和


50 mL/L CO2


恒温细胞培养箱中培养,


4 h


后吸去培养液和


尚未贴壁的细胞,换入等量培养液,置培养箱中备用,

< br>1


wk


内均可使


< p>
.




,用终浓度为


10


μ


g/mL


丝裂霉素


C


按上述方 法处理备用


.




wk


胚胎生殖嵴用


DPBS


冲洗


3


次;


400


U/mL


的胶原酶


0.5


mL,


37


℃下消化


45

< br>min



灭菌加样枪反复吹吸,


将生殖嵴离散为小细胞团;


1 g/L


的胰蛋白酶和


0.2 g/L EDTA


溶液,


37


℃下消化


5 min


;加入等


体积含


100


mL/L


胎牛血清的培养液终止反应;加入


2 00


U



Dnase



作用


10 min


;轻柔吹 打使细胞分离,胚胎干细胞培养液重悬后以


1


×


105,


1


×


10,


1


×


103/mL


三种浓度种植于


STO


细胞和


hELF


细胞饲养层,


胚胎干细胞培养液包含


8 00 mL/L


高糖


DMEM, 200 mL/L


胎牛血清


,2


mmol/L L


谷胺酰氨


,0.1 mmol/L


非必需氨基酸


,0.1 mmol/L 2


巯基乙



,10


μ


mol/L


Forskolin,


2


μ


g/mL


hrbFGF,


LIF


10


×


105


IU/L,


10


4



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