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RNA
的琼脂糖凝胶电泳
实验原理
RNA
电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。
非变性电泳使
用
1.0%--1.4%
的凝胶,
不<
/p>
同的
RNA
条带也能分开,但无法判断其
分子量。只有在完全变性的条件下,
RNA
的泳动率
才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定
RNA
分子量时,一定要用变性凝胶。在需快速
检测所提总
RNA
p>
样品完整性时,配制普通的
1%
琼脂糖凝胶
即可。
基本过程同
DNA
电泳一样,
但应明确
一点的是,
因为
RNA
分子对
RNA
酶的作用非常敏
感,因此必须用对
RNA
酶有抑制作用
DEPC
水来配置所有溶液
,所有与
RNA
接触的仪器和
装置都要严格处理以尽量减少
RNA
酶对样品的降解;另外,因为
RNA
分子有二、
三级结构
可以影响其电泳结果,因此电泳时应在变性剂存在下进行,常用的
变性剂为甲醛和戊二醛
。
RNA
非变性琼脂糖凝胶检测
实验材料、器具及药品
蘑菇的总
RNA
溶液。
电泳仪,电泳槽,电子天平,移液器,枪头,微波
炉,紫外透射检测
仪等。
琼脂糖,<
/p>
1XTAE
电泳缓冲液,
0.5
μ
g/ml
溴化乙锭(
EB
)
10X
载样缓冲液。
实验步骤
(
1
)用
1<
/p>
×
TAE
电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶,加
1
×
TAE
电
泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
(
2
p>
)
在超净工作台上,
用移液器吸取
总
RNA
样品
4
ul
于封口膜上。
在实验台上再加入
5
ul 1
×
TAE
电泳缓冲液及
1 ul
的
10X
载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。
(
< br>3
)打开电源开关,调节电压至
100V
,使
RNA
由负极向正极电泳,约
30min
后将凝胶放
入
EB
p>
染液中染色
5min,
用清水稍微漂洗。在
紫外透射检测仪上观察
RNA
电泳结果。
非变性电泳:
上样量超过
3ug
,
电压超过
p>
6V/cm
,
电泳缓冲液时间太长,
均可能导致
28S
和
18S
条带分不开。
使用
2ug
上样量,电压小于
6V/cm
,使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混
匀两极的缓冲液,是获得好的电泳结果的前提。
(
以
DNA
标准为参照,
28S
和
18S
分别位
于
2.0kb
和
0.9kb
左右。
)
变性电泳条带变淡:
EB
与单链的结合能力要差一些,故同样的上样量,变性电泳比非变性
电泳要
淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。
RNA
的变性琼脂糖凝胶检测
试剂:
(
1
)
p>
MOPS
缓冲液
(
10*
)
:0.4mol/L
吗啉代
丙烷磺酸
(
MOPS
)
(PH7.0)
,
0.1mol/L NaAc,
10mol/L
EDTA
。
(
2
)上样
染料:
50%
甘油,
1mmol/L
EDTA ,0.4%
溴酚蓝,
0.4%
二甲苯蓝。
(
3
)甲醛。
(
4
)去离子甲酰胺。
电泳槽清洗:去污剂洗干净(一般浸泡过夜)——水冲洗——乙醇干燥——<
/p>
3%H2O2
灌满——室温放置
10
p>
分钟——
0.1%DEPC
水冲洗。
操作:
(
1
)
p>
将制胶用具用
70%
乙醇冲冼一遍,晾干备
用。
(
2
)
配制琼脂糖凝胶。
①称取
0.5g
琼脂糖,置干净的
100ml
锥形瓶中,加入
40ml
蒸馏水,微波炉内加热使
琼脂糖彻底溶化均匀。
②待胶凉至
60--70
℃,依次向其中加入
9ml
甲醛、
5ml 10X MOPS
缓冲液和
0.5
ul
溴
化乙锭,混合均匀。
③灌制琼脂糖凝胶。
(
3
)
样品准备:
①
取
DEP
C
处理过的
500
ul
小离心管,依次加入如下试剂:
10x
MOPS
缓冲液
2ul
,
甲醛
3.5
ul,
甲酰胺(去离子)
10
ul
,
RNA
样品
4.5
ul,
混匀。
②
将离心管置于
60
℃水浴中保
10
分钟,再置冰
上
2
分钟。
③
向管中加入
3
ul
上样染料,混匀。
(
4
)上样。
(
5
)电泳
:电泳槽内加入
1XMOPS
缓冲液,于
7.5V/ml
的电压下电泳。
(
6
)电泳结束后,在紫外灯下检查结
果。
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