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RT-PCR
常见问题与分析
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作者：
来源：
日期：
2007-10-25
本站论坛
在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有
RT-
PCR
产物？
参考见解：
1
、
RNA
被降解：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析
RNA
；使用良好的无污染技术分离
RNA
；
在将组织从动物体取出后立刻处理；
在
100
％甲酰胺中储存
RNA
如果使用胎盘<
/p>
RNase
抑制剂，
不要加
热超过
45
℃或
pH
超过
8.0
，否则抑制剂或释放所有结合的<
/p>
RNase
。而且，在
≥0.8mM D
TT
时加入
RNase
抑制剂，一定要
存在
DTT
；
2
、
RNA
中包含逆转录抑制剂：过乙醇沉淀
RNA
除去抑制剂。用
70
％（
v/v
）乙醇对
RNA
沉淀进行
< br>清洗。
可以加入糖元
（
0.25
μg
到
0.4μg/μl
）
以帮助小量样品
RNA
的恢复；
< br>逆转录抑制剂包括：
SDS
，
E
DTA
，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐；将对照
RN
A
同样品混合，同对照
RNA
反应比较
产
量以检验抑制剂；
3
、
多糖同
RNA
共沉淀：使用氯化锂沉淀
RNA
以除去多糖；
4
、
用于合
成
cDNA
第一链合成的引物没有很好退火：确定退火温度适合
您的引物。对于随机六聚体，
建议在反应温度保温之前先在
25
℃保温
10
分钟；
对于基因特异性引物
（
GSP
）<
/p>
，
可以试一下其他
GSP
，
或换用
oligo(dT)
或随机六聚体确定
GSP
是反义序列；
5
、
起始<
/p>
RNA
量不够：增加
RNA
量；对于＜
50ng
的
RN
A
样品，可以在第一链
cDNA
合成中
使用
0.1μg
到
0.5μg
乙酰
BSA
；
6
、
RNA
模板二级结构太多：
将
RNA
和引物在不含盐及缓冲液条件下变性
/
退火；<
/p>
提高逆转录反应温度，
对
SuperSc
ript
Ⅱ可以到
50
℃，对
ThermoScript
可以到
65
℃。注意：不要在＞
60
℃时使用
oligo(dT)
引物，选择一个在反应温度可以退火的
< br>GSP
；对于＞
1kb
的
RT-PCR
产物，保持反应温度
≤65
℃。注意：不要在高于
37
℃时使用
M-MLV
；如果不需要全长
cDNA
，在第一链反应中使用随机引
物；
7
、
引物或
模板对残余的
RNA
模板敏感：在
PC
R
前用
RNaseH
处理。
8
、
靶序列在分析的组织中不表达：尝试其他靶序列或组织。
9
、
PCR
没有起作用：对两步法
RT-P
CR
，不要在
PCR
步骤中使用超过<
/p>
1/5
的逆转录反应产物；
10
、
PC
R
引物设计较差：
避免在引物
3'
端含有互补序列。
避免可以形成内部发卡结构的序列。
设计
Tm
类似的引物。最佳引物浓度介于
0.1μM
到
0.5μM
之间。为了精确确定引物浓度，在
260nm
测量光密
度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。
11
、
富含
GC
的模板：于
GC
< br>含量＞
50
％的模板，使用
PC
Rx Enhancer Solution
。
12
、
镁离
子浓度太低：从
1mM
到
3mM
，间隔
0.5mM
进行一系列反应，确定对于
每个模板和引物对
的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量
PCR
，使用
3mM
到
5mM
的镁离子浓度。
13
、
退火
温度太高：使用表
4
的公式估算
Tm<
/p>
，把退火温度设定为低于
Tm 5
℃。因
为这些公式只是估
算
Tm
值，所有真正
的退火温度实际会高些或低些。
在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带？
参考见解：
1
、
引物和
模板非特异性退火：在第一链合成中使用
GSP
，而不是随机引
物或
oligo(dT)
。试用允许高
温
cDNA
合成的
GSP
。
2
、
GSP
设计较差：遵循用于扩增引物设计的同样原则。
3
、
RNA
中沾染了基因组
DNA
：使用扩增级<
/p>
DNase
Ⅰ处理
RNA
。使用没有逆转录的对照反应检测
DNA
污染。
4
、
形成引物二聚体：设计在
3'
端没有互补序列的引
物。
5
、
引物和模板非特异性退火：以
2
℃到<
/p>
5
℃间隔增加退火温度，减少退火时间；在开始几个循环使用较<
/p>
高的退火温度，然后使用较低的退火温度；使用
Platinum
Taq DNA
进行自动热启动
PCR
；避免在引
物
3'
端含有
2
到
3
个
< br>dG
或
dC
；
< br>
6
、
镁离子浓度太高
：对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
7
、
因为扩
增复杂模板导致引物错误起始：使用巢式
PCR
或递减
PCR
。
8
、
沾染外
源
DNA
：使用抗气雾剂的吸头和
UD
G
。
9
、
因为二
级结构导致引物结合位点无法接近：对于
GC
含量＞
50
％的模板，使用（
1×
-3×
）
PCRx
Enhancer
Solution
。
定量
RT-
PCR
无扩增产量相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照？
参考见解：
1
、
无
cDNA
合成。
2
、
cDN
A
合成温度太高：降低保温温度。
3
、
反转录
cDNA
产物被二级结构封闭：提高保温温度。重新设计引物。
4
、
RNA
被损害或降解：必要的话更换
RNA
。
5
、
RNA
se
污染：维持无菌条件；加入
RNase
抑制剂。
6
、
荧光探
针无功能：确保探针设计的有效性和
fluorophore
和
quencher
的存在。用
DNas
e
处理
TaqMan
探针，校验荧光是
否增强。必要的话设计和合成探针。
灵敏度低，须在比预期更高的循环中检出产物
?
参考见解：
1
、
初始模
板
RNA
不充分：增加模板
RNA
的浓度；使用
10ng-1?g
的总
RNA
。
2
、
RNA
被损害和降解：必要的话更换
RNA
。
3
、
RNAse
污染：维持无菌条件；加入
RN
ase
抑制剂。
4
、
无效的
cDNA
：通过增加
70
％乙醇清洗的次数来去除制备
RNA
过程中的抑制剂
。
5
、
<
/p>
无效的
PCR
扩增：注意：反转录的抑制
剂包括
SDS
、
EDTA
、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。调
整
cDNA<
/p>
合成温度或引物设计。
信号高于预期，在低于预期的循环中即可检出产物？
参考见解：
1
、
反应中加的样品太多：降低模板的浓度。
2
、
模板或
PCR
残余污染：隔离污染来源，更换试剂，使用专用的精致移
液器。在无
DNA
区域准备反
应，使用
抗气溶胶的吸头。
是否
RNA
不用反转录，而直接
PCR
克隆出新基因？<
/p>
参考见解：
PCR
的底物是
DNA
，一定要反转录才行的。可以将
rt
和
pcr
连续进行，
主要是在同一个反
映管加入
taq
和<
/p>
rt
酶
,
逆转录
完成后用高温
(94c)
将
rt
酶灭活
,
然后再进行
pcr.
但是直接进行
pcr
是不
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