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Q
：做反转录
PCR
时，提取的
RNA
该怎么用
DNAase 1
处理？
A
：
DNAase
< br>Ⅰ处理的目的是去除基因组
DNA
，
PCR
后不会有基因组
DNA
污染
，扩出的
是没有
n
内含子的
cDNA
，从而降低做定量
PCR
的误差。
我原先也想买
DN
Aase
处理我提取的
RNA
，但是听
我们实验室的人说效果不好（我不知道
具体不好的原因）
，而且
增大
RNA
降解的机会，所以我就没有处理，直接
RT
了。接下去就
打算跨内含子设计引物做后续的荧
光定量
PCR
（现在还没有做，呵呵
~
）
。
我看见
有人是这样处理的
(
不知到对你是否有用
):
把酶加到
TE
溶液中（用
RNase-Free
的水配）
，先配成<
/p>
10mg/ml
的母液后煮沸
15min
，冷
却后放冰箱
-20
度保存，用时稀释
50
倍，
1
00
倍看你自己了，然后就是混合
RNA
，
37
度处
理三十分钟。你可以问试
剂供应商要一张
DNAase
的试剂说明书，我想，如果是好的
试剂，
里面都有说明说的，而且说得比较清楚。
Q
：现在已经提取出总
RNA
了，需要做逆转录成
cDNA
，然后再做荧光定量
PCR
来观察基
< br>因表达量的多少。在这个实验中逆转录时的引物可以直接用荧光定量
PCR
的引物吗？还是
有什么特殊的要求呢？
A
：
如果是两步法做的话，
反转录通常用的是随机引物或者
oligoT,
这样当
然是无法用于
PCR
步骤的，需要重新选定基因特异性引物。为
了避免
RNA
中有
DNA
染色体污染的的问题，
在反转录以前最后做
DNas
e
处理，或者在设计
PCR
引物时，让
上下游引物处于不同的外
显子上（跨越内含子）
做逆转录时的基因特异引物只要扩出的条带无杂带，特异性强
，扩增产物长度在
150-300bp
之内就可以用于荧光定量
PCR
。
Q
：
1.“
随机引物
”
是什么意思，自己如何设计
呢？
2.“oligoT”
是不是指
一段
TTTTTTT……TTTTTT
的引物，如果是，要多长
，几个
T
呢？
3.
逆转录出的
cDNA
要用于后续
的实时荧光定量
PCR
，
“
随机引物
”
和
“olig
oT”
各自的优缺点
都是什么？
4.“
在反转录以前最后做
DNase
处理
”
，具体是怎么做的？说得详细一点，
呵呵
~
5.
让上下游引物处于不同的
外显子上（跨越内含子）
，这样做的目的是什么？
6.
我看见园子里有人说要用
“TE”
调零和稀释
RNA
，
但是
我在用紫外分光光度计测定
RNA
浓
度
时，
直接用
DEPC
处理过的水调零和
稀释
RNA
的。
我这样做可以吗？
“TE”
具体是指什么
呢？
A
：
如果你只检测一个指标
，
可以用特异性引物，
这样就可以避免
RT-PCR
过程中不同基因
转录效率不一致所造成的误差。<
/p>
但是如果你要检测几个样本，你可以用
oligo
dT
或
random
hexamer
，不需要自己买，
RT-
PCR
试剂盒内有。前一段时间
bio-rad
工程师做
Presentation
时说：现在文献内
做
realtime
PCR
的用特异性引物、
oligo
dT
和
random hexamer
各占
30%
，
剩下
10%
用
oligo
dT+random
hexamer
。如果你的引物靠近
5?
端，且
mRN
A
超过
3000bp
，最好用
random
hexamer,
否则都可以。
DNase
一般的
RNA
提取试剂盒内会有。
转成
cDNA
后常规
PCR
检测
RT
是否成功，
primer
是否特异，退火温度
然后用一个样本
2-10
倍倍比稀释做
realtime PCR
，测定每对引物的
efficiency
。
然后检测样本，采用公式计算
Ratio
。现在
paffle
（可能拼错了）的
公式比较流行。
如上所言，随机引
物和
oligoT
都是商品化的，可以倒产品目录上看到相关信
息。
oligo
T
只能对具有
ployA
的
mR
NA
进行反转录，它和随机引物的应用在分子克隆上有论述。
DNase
处理是防止提取
RNA
的过程中基因组
DNA
污染造成
PCR
中假阳性而采取的手段，
如果
是用
Qiaogen
的试剂盒提取
< br>RNA
，参照其说明书进行；如果是用
TRIZOL
提前，在正常提取
完成后，将溶解好的
RN
A
样品按照
DNase
的说明书进行操
作。
跨越内含子的设计目的同上，如果引物设计在同一个外显
子上，有
cDNA
和污染的基因组为
模
版获得的
PCR
产物无法区分，如果引物设计在不同外显子上，
以
cDNA
为模版扩增的目的
产物比较
小（因为
mRNA
上内含子被切除了），且扩增效率较高，而以
污染的基因组
DNA
为
模版的
PCR
获得的产物要大一些
（因为包括内含子序
列）
，
扩增效率会低，
甚至扩增不出来
。
据说
TE
在紫外上信号相对稳定，其配方见分子克隆。
Q
：
我是按
照两步法做逆转率荧光定量
PCR
。
现
在已经买到
RT
试剂盒了，
马上要开始
做逆
转录这一步。试剂盒的东西还是很全的，里面有三种引物：
oligo T
，随机引物，对照引物。
我的样本
RNA
是用
Trizol
提的，是不是在逆转录以前必须要用
DNA
酶处理所提的
RNA
？
我听有人说
，
可能是
DNA
酶本身的因素，
用
DNA
酶处理
RN
A
也会引起
RNA
降解的危险。
如果我用
Trizol
提出
RNA
，
不做
DNA
酶处理这一步骤，
而是直接逆转录，
然后设计跨越内
含子的
PCR
引物进行荧光定量
PCR
。这样的做法可取吗？
A
：
我们试验室也不做
dna
酶处理这一步，直接反转录，可以将荧光定量的引物设在
两个外
显子上，这样就会避免有
dna
的污染产生杂带，还有更可靠的是将上下游都引物设在外显
子的交接处，但是很少有序列
能这样设出来。
Q
：
听说做荧光定量
PCR<
/p>
用到的材料和普通
PCR
的差不多，
只是多了染料，
是这样吗？还
有，
就
RNA
的质和量而言，
做荧光定量
PCR
比做普通
PCR<
/p>
要求更高吗？具体高在那些地
方呢？
<
/p>
我这几天也从组织提了
RNA
，然后做了
RT
。我对
RNA
和
RT
的产物都做了电泳，但是不
知道自己的实验结果好不好，麻烦大家帮我看看存在什么问题。下面是
RNA
电泳图片：