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广州达安临床检验中心作业指导书
编号：
GZDA-SOP-XBYC-XM001
染色体
G
显带操作规程
第四版
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染色体
G
显带操作规程
1.
目的：规范细胞遗传（外周血）诊断的操作过程
，以保证结果的准确、可靠。
2.
应
用范围：外周血细胞遗传标准实验操作及核型分析。
3.
职责：
3.1
文件编写：实验室技术员。
3.2
文件审核：科室负责人。
3.3
文件审批：实验室主任。
3.4
执行：细胞遗传室的所有工作人员。
4.
内容：
4.1
实验原理：
4.1.1
．淋巴细胞的体外培养
<
/p>
4.1.1.1
．外周血（脐带血）中的淋巴细胞几乎都是处在<
/p>
G
0
期或
G
1
期，一般情况下是不分裂的。当在培养
基
中加入植物血凝素（
phytohemagglutinin
，
PHA
）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，<
/p>
并开始进行有丝分裂。
4.1.1.2
．离体培养的人体淋巴细胞的有丝分裂周期分为四个时期：
DN
A
合成前期（
G
1
期）
，约
10
～
< br>24h
，为
RNA
和细胞质的合
成；
DNA
合成期（
S
期）约为
7h
，在
G
1
期的基础上，完成
DNA
的合成；
DNA
合成后期（
G
2
期）约为
4
～<
/p>
6h
，为后期
RNA
和细胞质的合成，活跃的
RNA
和微管蛋白等合成；细胞分
裂期（
M
期）约为
1.5h
，又分为分裂前期、中期、后期和末期。
4.1
.1.3
．培养基分为天然培养基和人工培养基两种；实验室常用的外周血淋巴细胞培养
基为二者的混合
培养基，主要由
RPMI1640
和牛血清混合而成。另外培养液中加有肝素钠用于防止血液的凝固，平衡盐溶
液维持培养液的渗透压和
pH
，双抗（链霉素和青霉素）用于抑
制细菌的生长等。
4.1.2
．纺锤体的抑止
4.1.2.1
．在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染色体紧靠在一起
，很难进行分析。因此，破坏纺锤体，
使染色体依然呈游离状态，不再粘附至细胞内任何
结合力上，在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就
很容易铺展开来。细胞分裂中纺锤
体是由微管组成的。微管由微管蛋白组成，微管蛋白分
α
微管蛋
白和
β
微管蛋白两种，
α
微管蛋白和
β
微管蛋白彼此间具有很强的亲和力，常
呈二聚体形式存在。其中
β
微管蛋
白肽
链中第
201
位的半胱氨酸为秋水仙素与之结合的部位，秋水仙
素与之结合后会引起微管解聚。故秋水
仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细
胞分裂的作用。但是这一作用不影响染色体的复制和着
丝粒的分裂，因此它可使分裂的细
胞停留在中期，获得大量分裂相，以供分析之用。
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4.1.2.2
．秋水仙素（
colc
hicum
）是一种生物碱，因最初从百合科植物秋水仙（
Co
lchicum autumnale
）
中取出来，故名。分子
式
C
22
H
2
5
O
6
N
，纯
秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点
157
℃，易溶于水、乙醇和氯
仿，难
溶于热水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色
体停滞在分裂中期。这
种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂（
C-mitosis
）
。在这样的有丝分裂中
，染色体虽
然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而染色体加倍。秋水仙素是
一种三环结构化合物，第
2
和第
3
个环均是
7
元环。它是甲基醚的类似物，包
含
4
个甲氧基，
1
个乙酰化的初级氨基以及
3
个非苯型
双键。秋水仙素分子的第一个环上由三个甲氧基，这是作用活性不可缺少的反应基团；第二个环内的氨基
被酯化，从而可增加其活性；第三个环的水合基团被甲基取代。正因为如此，秋水仙素不仅易溶
于水，而
且即便所用的浓度极低，其反应活性仍很高。
4.1.3
．低渗
< br>4.1.3.1
．细胞经过秋水仙素处理后，尽管染色体已经比较适合观察了，但
仍还不能满足要求，因为人类
细胞的染色体数目多，形状小，最大的染色体约为
7
～
8
微米，加之主要
的观察与分析均在油镜下进行，
这就要求标本中的染色体彼此散开，并且尽可能处于同一
平面上，这些均有赖于低渗处理。覆盖在染色体
上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散
，低渗液的渗透作用不仅可使粘附于染色体的核仁物质散开，清
楚地显示每一个扭曲的染
色体，而且还可以使细胞膨胀，染色体铺展。
4.1.3.2
．低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。可以是水，低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘
油磷酸
钾（
0.65mol
／
L
）
、氯化钾（
0.0
75mol
／
L
）
、稀释的平衡盐溶液或培养基。处理的时间一般为
20
～<
/p>
40min
，
处理时的温度为
23
～
37
℃。
早期研究中多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低渗液，
也有些学者使用稀释的
人血
清。自从
1965
年后，人们改用
0.075mol
／
L
的
KCl
作为低渗液，它可以使染色体的轮廓清楚，可
染色性
增强，染色时间缩短。在相差显微镜下观察，
KCl
低渗处理标本的效果比其他低渗液更好，也适用于显微
分光光度分析
，当用显带染色时充分显示带型的特点。
4.1.4
．固定
< br>4.1.4.1
．固定是将组织细胞或其成分选择性地固定于某一特定阶段的过程
，其目的是在杀死细胞的同时
避免所研究成分受到破坏。就细胞遗传学研究而言，固定的
目的是在于提高染色体结构的可见性和显示染
色体形态的细节，例如显示常染色质区和异
染色质区，初级缢痕和次级缢痕等。
4.1.4.1.1
．经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种不同的固定液（金属固定液或非金属固定液）予以固定
，
但一定要在固定之前把秋水仙素从组织细胞上冲洗掉，否则，沉积在细胞表面的秋水仙
素会影响染色体的
形态，还会阻碍固定液穿透性。为此，在低渗处理后，应尽早加入固定
液进行预固定。固定剂可迅速地穿
透细胞，并将细胞瞬间杀死，使正在分裂的细胞立即阻
留在各自特定的细胞周期时相上，否则原有的
M
期
细胞的核分裂会继续下去，染色体松解为染色质，导致研究无法进行。另外，预固定可使细胞都处于相
同
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的固定微环境中，这样固定收获的细胞不会凝结在一起。
4.1.4.1.2
．为使染色体结构不受破坏，提高染色体的可见
性及染色体的嗜碱性，就需要是染色质物质沉
淀。
在活体条件下
，
细胞内不同成分的折射系数之间相差较小，
在显微镜下不能分
辨出明显的染色体结构；
随着核蛋白的凝结和沉淀，
染色体的折
射系数将会发生很大的变化，
从而使它们在细胞内成为明显的小体。
因此迄今所用的固定剂都具有交联蛋白的特性，都能使染色质沉淀。常用的染色体固定剂往往是数种化学
物的混合物，其中至少有一种化学物必须具备这一特性。
4.1.4.1.3
．随着细胞的死亡而出现的另一些变化（特别是蛋白
质的自溶作用）
，往往会破坏染色体的原来
结构。在正常情况下
，细胞内的酶参与蛋白质的合成，而当细胞死亡时，由于介质变为酸性，这些酶便在
相反
方向起作用，即使是复合蛋白质裂解为简单的氨基酸也是如此。因为多肽是染色体的主要成分之一，
所以，这种变性效应最终引起染色体结构的破坏。因此，作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自溶作用
。
此外，在细胞致死的同时，细菌的活动猖獗致使细胞内成分的分解。因此一种好的固定
剂当既能起到防腐
作用，又能阻止这种分解作用。
4.1.4.1.4
．理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果，即
能增强染色体的嗜碱性。显而易见，没
有哪一种化学物能同时具备以上这些条件，因而通
常是将数种可以共存的液体混合起来，使之成为染色体
研究中真正有效的固定剂。尽管如
此，哪怕是最佳的固定剂，仍难免有不足之处。首先细胞被杀死后发生
的一些变化很难予
以避免；其次，可能会抽提出一些弥散成分，最后，即便是操作十分谨慎，仍难以保持
酶
活性不变。此外，有一些化学物还会导致细胞的皱缩。
4.1
.4.2
．用作固定剂的化合物又可分为非金属的和金属的两大类。前者如乙醇、甲醇、
醋酸、甲醛、丙
酸、苦味酸和氯仿等；后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀和醋
酸镧等。其中有几种化合物还可
作为蒸汽固定剂（
Vapour
fixative
）
，也即在接触水或其它溶剂之前使可溶性物
质先转变为不溶性物质，
这样就可以在原位制作标本。另外，按照正在细胞内沉淀蛋白质
的特性不同，又可把固定剂分成沉淀性和
非沉淀性两种。沉淀性固定剂如铬酸、氯化汞和
乙醇等，非沉淀性固定剂如四氧化锇、重铬酸钾等。
4.1.
4.2.1
．醋酸是一种理想的染色体的固定剂，它能使核酸沉淀，使组蛋白溶解，但却
不能固定细胞质
蛋白。在染色体结构的研究中，醋酸的主要用途是阻止染色体收缩，使染
色体的结构免于破坏。经醋酸固
定的物质还能抵消乙醇的硬化作用。它可使染色体结构保
持完整，且多半不致破坏核蛋白。这种固定剂的
一个缺点是会导致染色体片段的过分膨胀
，因此如果要研究染色体的详细结构，必须把它与乙醇或类似的
化合物一道使用，后者能
使组织收缩和硬化。醋酸作为固定液中的一种成分具有以下优点：
?
可以与迄今
所用的任何一种固定剂同时使用；
?
浓度可以很低或很高；
?
具有很强的穿透性能。此
外，醋酸还是苯胺
类染料的一种优良溶剂。因此它是染料和固定液混合物中必需的一种成
分，例如醋酸
-
洋红、醋酸
-
奥辛和
醋酸
-
间苯二酚
蓝等
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4.1.4.2.2
．甲醇是焦木酸的一种成分，从木材分解蒸
馏制得，广泛地用于动物染色体的固定。它可以使
蛋白质沉淀，
还具有脱水性，
可使蛋白质出现不可逆转的变性，
使组织硬化，
但其不能有效地固定染色体，
易被氧化剂氧化成甲酸，故不能与
氧化剂共存。甲酸是一种无色有毒的液体且可以任何比例与水混合。
< br>4.1.4.2.3
．乙醇的有效浓度与甲醇一样。它和甲醇一样可以使蛋白质沉
淀，还具有脱水性。可使蛋白质
出现不可逆转的变性，使组织硬化。但是在有氧化剂存在
时乙醇会很快被氧化为乙醛，并进而变成醋酸。
它最重要的优点是能够迅速地穿透人组织
。因此，乙醇也被广泛地用作染色体固定剂的一种成分。乙醇不
能与许多金属固定剂（铬
酸或四氧化锇）相混用，否则会被氧化。此外乙醇不能有效地固定染色质，原则
上也不能
与醋酸、甲醛或氯仿混合使用。但是如果要对染色体的酶进行研究时，可以用
80%
冷乙醇固定
1h
或更多时间；如用于单层培
养物，往往以纯乙醇或
95%
的乙醇固定
1
～
15min
，因为酶的反应基团
一般是不
受乙醇破坏的。
4.1.4
.2.4
．
1886
年
Carnoy
首先用醋酸、乙醇混合作为固定剂，故名为卡诺固定液。其特点是
穿透快，且
很利于染色体结构的研究。目前常用的卡诺固定液是由
1
份冰醋酸和
3
份甲醇混合而成的。
所有的动植物
和人类染色体的固定都可以用卡诺固定液，固定时间为
15min
至
24h
，温度为室温
或稍冷。随着醋酸比例
的增高，
固定液膨胀的效能加大，
有利于染色体的铺展，
因此必要时可以改变酸和醇的比例，
例如改成
1:2
或
1:4
等，但是如果过度膨胀则会导致细胞破碎，反而不利于分析。卡诺固定液中缺乏有助于染
色体嗜碱
性的金属成分，因此经这种方式固定的组织不能被许多碱性染料的水溶液染上色
，除非使用一些特殊的媒
染剂如铬酸。
4.1.5
．制片
< br>4.1.5.1
．固定完成后就进入制片阶段。早期多采用涂片法、挤压法，后来
很快被气干法取代，现今气干
法在哺乳类和人类细胞遗传学中广泛应用。
4.1.5.2
．涂片法（
smear
）
：细胞是在固定之前就铺展到载玻片上的，而且无
需什么处理便可使细胞分散
开，整个操作迅速，很适于精细观察。
4.1.5.3
．挤压法（
squ
ashing
）
：需要在固定或染色之后给以特殊的处理，然后
放上盖玻片加压，如此方
能从结实的细胞团块得到散开的细胞。但标本会临时性和逐步性
变质，且操作不是很方便。
4.1.5.4
．气干法（
air d
rying
）
：主要用于那些容易做成细胞悬液的组织，例如骨
髓、外周血淋巴细胞、
腹水和生殖上皮细胞等。所制片的染色体铺展较好，且处于同一焦
平面上，操作较为简单，标本上的细胞
密度较高，便于观察与分析。
4.1.6
．染色
4.1.6.1
．染色体的结构和行为只能在显微镜下进行研究。鉴于休止
期的细胞核和分裂中的染色体折光指
数差别甚小，未染色的标本在普通显微镜下很难予以
观察，所以需要相差显微镜观察。但是在相差显微镜
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