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快速的操作，低温环境，少量取上清
主要是抽
提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有
RNase
污染。
分子克隆第二版
3
43
页
,
上关于提取
< br>R
NA
所用的玻璃容器的处理方法
,
是用前
180
度干烤
8
小时或更长时间
;
另一种
方法是
0.1%
的
depc
水浸泡
(37
度
2
小时
),
然
后灭菌水
淋洗数次
,100
度干烤
15
分钟
,
然后高压灭菌除去
depc.
我们实验室一直是用
170
度考
4
小时
,
且不准离人
,
不准过夜
,
可能是怕烤箱长时间高温
,
线路老化
会发生危险吧
提取
RNA
所用的枪头，
EP
管。直接高压烘干即可。如果用
0.1
％
DEPC
处理，要在
DEP
C
配置后振摇
1
小时后再浸泡枪头，<
/p>
EP
管方有效。我做的都是将枪头泡
在配
制好的
depc
中，摇振过夜，然后倒掉
depc
注意要到干净，再高压，为了防止仍残留液体可
12
0
度干烤一会
A.
对于提取
RNA
来说
,
我认为关键的一点在于实验器材的准备
.
包括从最初的标本的制备
,
保存
,
以及之后的试剂的准备
,
匀浆器
,
镊子
,tip
头的去除
RNase
处理
,
尤其
是去除
RNase
的
DEPC
处理步骤
B.
您在处死大鼠前
,
先准备好干净的冻存管
(
用
1.5m
l
的
Ep
管也可以
,
就是后面您在从液氮中取出的时候容易爆
,
您的注意安全
),
然后将去除的骨骼肌立即用干净的
剪刀分成半颗到一颗黄豆大小
,
装入冻
存管后立即投入液氮保存
.
个人认为在这里使用装标本的管子没
必要用
DEPC
处理
C.
在提取
RNA
之前
,
将试剂
(TRIzol)
< br>和器械
(tip
头
,
镊子
,
匀浆器
)
都准备好
D.
从液氮
取出标本后
,
立即转移进入事先加入
T
RIzol
的匀浆器内
(
最好置冰上操
作
),
立即匀浆
,
一直到标本完全碾磨碎
,
这个时候
TRIzol
液体成浑浊状
,
而且匀浆
器
的壁上没有太多的黏附组织
,
然后将
TRIzol
转出
,
< br>继续后续的步骤
.
1 Rn
ase
是一种蛋白酶，能够降解
RNA
。
2
我们的手上皮肤上有很多，应该
是对我们的身体起保护作用。保护不被
RNA
病毒感染？或者什
么的。
3
这个酶高效稳定。要么在
DEPC
水中处理
n
< br>小时，要么在
160
度高温烘烤
6
小时。此酶才会失效。
4
所谓
DEPC
，是一种叫做焦碳酸二乙酯的东
西。有毒啊。所谓
DEPC
水，一般指两种状态，
a
，配制
好未消毒；
b
，配制好已消毒。通过高压消毒，该物质会
降解，从而无毒。
1
无菌蒸馏水
中加入
0.1%(v/v)
焦碳酸二乙酯（
DEPC
）
，室温搅拌
4
小时以上至完全溶解，高压灭菌
20
分钟，冷却
备用。这个是
DEPC
水的
b
状态。
2
如果你要
用
DEPC
水处理
Tips
等等东东，那么就要用高压前的水，即
DEPC
水
的
a
状态。把枪头管子等完全浸泡至少
8
小时，我一般都是过夜的，或者平时
就泡在里面备用。
RNA
提取必须
创造无
RNas
e
的环境，所有仪器与
试剂均按照以下方法进行处理
：研钵、研棒、药匙、玻璃器皿
等需在
180
℃烘
干
< br>4h
以上；
电泳槽、胶板、<
/p>
梳子、
用
0.1 %
～
0.2%DEPC
水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用
0.5%
的
SDS (Sodium
dodecyl sulfate
，
抑制
RNase
的活性
)
浸泡过夜，
然后用
ddH2O
冲洗
干净，
晾干备用；
离心管，
枪头等
塑料器皿要用
0.1%
～
0.2%
DEPC
水处理之后
(DEPC
有致癌之嫌，
须小心操作
)
。
37
℃保温
12h
以上，
然后高压灭菌，
灭活
D
EPC
( Diethypyrocarbonate )<
/p>
；溶液都需用经
DEPC
处理过的水配置
，
RNA
提取的所有操作应尽可能在
超净工作台上进行。
我们研究所里提
RNA
用的枪头和
EP
管都是高压两遍的，没有用
DEPC
水处理。
1
、
有灭菌
过的
DEPC
水，这一般是用来配
75
%
乙醇用，因为乙醇若高压灭菌会挥发，所以乙醇是新开封专用的。
2
、
没有经高压灭菌的
DEPC
水，这主要是用于配你提
RNA
所用的其他试剂（所说的试剂是可以经高压灭菌的）
，总的来说，都得经过高压灭菌，目的就是要
去除
DE
PC
，以防止它以随后实验的干扰。
3
、
DEP
C
处理水：无菌蒸馏水中加入
0.1%(v/v)
焦碳酸二乙酯（
DEPC
）
，室温搅拌
4
小时以上，
121
度高压灭菌
20
分钟，冷却备用。
凡是不能用高温
烘烤的材料如塑料容器等皆可用
0.1%
的焦碳酸二乙酯
(DEPC)
水溶液处理
,
< br>再用蒸馏水冲净。
DEPC
是
R
NA
酶的化学修饰剂
,
它和
RNA
酶的活性
基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶
活性。
DEPC
与氨水溶液混合会产生致癌物
< br>,
因而使用时需小心。试验所用试剂也可用
DEPC
处理
,
加
入
DEPC
至
0.1%
浓度
,
然
后剧烈振荡
< br>10
分钟
,
再煮
沸
15
分钟或高压灭菌以消除残存的
< br>DEPC,
否则
DEPC
也能和
腺嘌呤作用而破坏
mR
NA
活性。但<
/p>
DEPC
能与胺和巯基反应
,
因而
含
Tris
和
DTT
的试剂不能用
DEPC
处理。
Tris
溶液可用
DE
PC
处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌
,
可用
DEPC
处理水配制
,
并尽可能用未曾开封的
试剂
.
为啥在
28s
之后还是有影影约约的片断？和模糊的
smear<
/p>
？
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