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PCR
仪常见问题及回答
1. cDNA
产量的很低
可能的原因：
＊
RNA
模板质量低
＊对
mRNA
浓度估计过高
＊反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
＊同位素磷
32
过期
＊反应体积过大，不应超过
50μl
2.
扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
< br>＊最常见的原因在于您的反应体系是
PCR
的反应体系而
不是
RT-PCR
的反应体系
＊与反应起始时
RNA
的总量及纯度有关
＊建议在试验中加入对照
RNA
＊第一链的反应产物在进行
PCR
扩增时，在
总的反应体系中的含量不要超过
1/10
＊建议用
Oligo(dT)
或随机引物代替基因特异性引物（
GSP
）用于第一链合成。由于
RNA
模
板存在二级结构，如环状结果，有可能导致
GSP
无法与模板退火；或
SS
Ⅱ反转录酶无法从<
/p>
此引物进行有效延伸。
＊目的
mRNA
中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：
a.
将第一链的反应温度提高至
50
℃。
b.
使用随机六聚体代替
Oligo(dT)
进行第
一链反应。
3.
产生非特异性条带
＊用
RT
阴性对照检测是否被基因组
DNA
污染。如果
RT
阴性对照的
PCR
结果也显示同样
条带，则需要用
DNase I
重新处理样品。
＊在
PCR
反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在
低于引物
Tm 2
至
5
℃的
温度下进行退火，降低镁离子或是目的
DNA
的量将减少非特异性结果的产生。
＊由于
mRNA
剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同
的
RT-PCR
结果。
4.
产生弥散（
< br>smear
）条带
＊在
PCR
反应体系中第一链产物的含量过高
＊减少引物的用量
＊优化
PCR
反应条件
/
减少<
/p>
PCR
的循环次数
＊在用
DNase
处理被
DNA<
/p>
污染的
RNA
样品时，其产生的寡核苷酸
片段会产生非特异性扩
增，一般会显示为弥散背景。
5.
产生大分子量的弥散条带
＊大多数情
况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的
＊对于长片段的
PCR
，建议将反应体系中
< br>cDNA
的浓度稀释至
1:10
（或
1:100-1:200
）
6.
在无反转录酶的情况下，对照
RNA
获得扩增结果
＊通常是由于对照
RNA
中含有痕量
< br>DNA
而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的
D
NA
模板消除。建议可将第一链
cDNA
稀释
1:10
、
1:100
、
1:1000
倍以消除
DNA
污染所造
成的影响。
＊有可能是引物二聚体的条带
7.
扩增产物滞留在加样孔中
＊有可能是由于模板量过高而导致
PCR
结
果产生了高分子量的
DNA
胶状物。建议将第一
链结果至少稀释
100
倍再进行二次扩增。
＊另外，
在二次
PCR
时使用的退火温度如果比引物的
Tm
值
低
5
℃，
可以将退火温度适当增
高或进行热启动以提高特异性。
8. SS
Ⅲ与
SS
< br>Ⅱ有何不同？
＊具有更高的热稳定性（达
50
℃）
＊具有更长的半
衰期（达
220
分钟）
＊对
PCR
无抑制
＊干冰运输
＊
Tdt
活性更低
9.
为什么有人更喜欢用
SS
Ⅲ而不是
ThermoScript
？
ThermoScript
如果保存
不当会引起活性很快降低，
SS
Ⅲ则更稳定。
< br>
10.
为什么使用基因特
异性引物（
GSP
）？
GSP
在扩增低丰度的转录本时是最好的。
Olig
odT
引物建议用于高质量
RNA
及全
长转录本
的逆转录；随机引物用于
mRNA
片段的逆转录。
11.
什么情况下需要使用
RNase
H
？
在第一轮
PCR
中
RNA/DNA
杂合体不能
正常变性时
12.
根据不同的目的选择不同的系统：
目的
建议
RT
与
PCR
使用不同的引物
或需要灵活选择
PCR
DNA
聚合酶
两步法
RT-
PCR
系统
高灵敏度
一步法或两步法
RT-
PCR
系统
高特异性
含有适当的
DNA
聚合酶的两步法
RT-
PCR
系统
或具有高保真
Platinum
Taq
酶的一步法
RT-
PCR
系统
高保真度
含有
Pfx
Taq
酶的两步法
RT-
PCR
系统
长的反转录结果
通常使用两步法
RT-
PCR
系统可达到最佳结果
含
Elongase
酶的一步法
RT-
PCR
系统
二、
Generacer
1.
如何针对
Generacer
试剂盒设计基
因特异性引物（
GSP
）？
使用
5’
或
3’RAC
E
试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几
点要求：
＊
50-70
％的
GC
含量，以提高引物熔点（
Tm
）
＊
23-28
个碱基长度，以提高引物特异性
＊降低
3’
端
GC
含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低
2.
为什么得不到
RACE
产物？
＊加入
Hela
对照
＊
低质量的
RNA
模板
＊逆转录失败，
SSII
和
S
SIII
非常适用于长模板
cDNA
的
合成
＊目的基因丰度太低，可以通过提高
PCR
的循环次数来解决，建议使用巢式
PCR
＊目的基因没有表达，可以通过使用两条
GSPs
来分析
cDNA
中是否含有目的基因
＊目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用
GeneRac
er
试剂盒中的
Oligo
dT
来得到全
长
cDNA
，使用随机引物或与模板的
5’
端尽可能近的
GSP
进行
PCR
。
＊
cDNA
模板属于
困难模板，可以通过以下方法解决：优化
PCR
反应参数及反应
体系；降
低退火温度；使用
5-10
％
的
DMSO
帮助通过高
GC
含量区；使用高保真度和高延伸能力的
酶进行
PC
R
反应。
3. RACE
的
PCR
结果有杂带
RACE PCR
杂带或非特异性
PCR
条带可能是由于以下原因：
＊
GSP
与其他
cDNA
的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。<
/p>
＊
GeneRacer
引物和
cDNA
的非特异性结合会导致产生一端带有<
/p>
GeneRacer
引物序列的
PCR<
/p>
产物。
＊
RN
A
降解。
＊
PCR
管或试剂污染。
注意：杂带一
般是因为没有优化
PCR
条件，可以加入阴性对照来确定。
4.
得不到全长的
5’RACE
PCR
产物
＊
CIP
反应后的
RNA
降解产生了新
的带有
5’
磷酸的断裂模板，
可以同<
/p>
GeneRacer RNA Oligo
连接。一定要小心操作
，保证
RNA
无降解。
＊
CIP
脱磷酸不完全，可以增加反应中
CIP
的量或减少
RNA
的量。
＊
PCR
产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化
PCR
。
二、
Generacer
1.
如何针对
Generacer
试剂盒设计基
因特异性引物（
GSP
）？
使用
5’
或
3’RAC
E
试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几
点要求：
＊
50-70
％的
GC
含量，以提高引物熔点（
Tm
）
＊
23-28
个碱基长度，以提高引物特异性
＊降低
3’
端
GC
含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低
2.
为什么得不到
RACE
产物？
＊加入
Hela
对照
＊
低质量的
RNA
模板
＊逆转录失败，
SSII
和
S
SIII
非常适用于长模板
cDNA
的
合成
＊目的基因丰度太低，可以通过提高
PCR
的循环次数来解决，建议使用巢式
PCR
＊目的基因没有表达，可以通过使用两条
GSPs
来分析
cDNA
中是否含有目的基因
＊目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用
GeneRac
er
试剂盒中的
Oligo
dT
来得到全
长
cDNA
，使用随机引物或与模板的
5’
端尽可能近的
GSP
进行
PCR
。
＊
cDNA
模板属于
困难模板，可以通过以下方法解决：优化
PCR
反应参数及反应
体系；降
低退火温度；使用
5-10
％
的
DMSO
帮助通过高
GC
含量区；使用高保真度和高延伸能力的
酶进行
PC
R
反应。
3. RACE
的
PCR
结果有杂带
RACE PCR
杂带或非特异性
PCR
条带可能是由于以下原因：
＊
GSP
与其他
cDNA
的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。<
/p>
＊
GeneRacer
引物和
cDNA
的非特异性结合会导致产生一端带有<
/p>
GeneRacer
引物序列的
PCR<
/p>
产物。
＊
RN
A
降解。
＊
PCR
管或试剂污染。
注意：杂带一
般是因为没有优化
PCR
条件，可以加入阴性对照来确定。
4.
得不到全长的
5’RACE
PCR
产物
＊
CIP
反应后的
RNA
降解产生了新
的带有
5’
磷酸的断裂模板，
可以同<
/p>
GeneRacer RNA Oligo
连接。一定要小心操作
，保证
RNA
无降解。
＊
CIP
脱磷酸不完全，可以增加反应中
CIP
的量或减少
RNA
的量。
＊
PCR
产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化
PCR
。
三、
PCR
在进行
< br>PCR
时：
＊请确保您没有使
用过量的起始
DNA
或者过高浓度的引物，也没有加入过量的<
/p>
Mg++
＊请确保您使用了恰当的退火温度
＊
请确保您没有使用过量的
DNA
聚合酶
四、引物
1.
应该选择哪种纯化方法？
取决于实验目的和引物的长度
2.
为什么我订购了
50nmol
，但是收
到却只有
40nmol
？
50nmol
是起始量
3.
怎样制备
100μM
的储液？
体积（
μl<
/p>
）
=
质检报告上的
nmol
数目
×
10
4.
怎样设计引物？
＊一般长度
20-30bp
；
＊至少
50%
的
< br>GC
含量；
＊避免引物二聚体和二级结构；
＊引
物对的
Tm
值应该接近。
5.
引物序列有插入或缺失？
＊使用上游和下游引物多测几个克隆。
＊请选择正确的纯化方法。
6.
PCR
无结果？
＊请检查引物设计是否正确；
＊请检
测
OD
读数是否正确；
＊做一个阳性对照和一个阴性对照
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