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PCR
常见问题集锦
1.
cDNA
产量的很低
可能的原因：
*RNA
模板质量低
*
对
mRNA
浓度估计过高<
/p>
*
反应体系中存在反转录酶抑制剂或反
转录酶量不足
*
同位素磷
32
过期
*
反应体积过大，不应超过
50μl
2.
扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
*
最常见的原因在于您的反应体系
是
PCR
的反应体系而不是
RT-
PCR
的反应体系
*
与反应起始时
RNA
的总量及纯度有关
*
建议在试验中加入对照
RNA
*
第一链的反应产物在进行
PCR
扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过
1
/
10
*
建议用
Oligo(dT)<
/p>
或随机引物代替基因特异性引物（
GSP
）用于第一链合成。由于
RNA
模板
存
在二级结构，如环状结果，有可能导致
GSP
无法与模板退火；
或
SS
Ⅱ反转录酶无法从此
引物进行有
效延伸。
*
目的
mRNA
中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：
a.
将第一链的反应温度提高至
50
℃。
b.
使用随机六聚体代替
Oligo(dT)
进行第一链反应。
3.
产生非特异性条带
*
用
RT
阴性对照检测是否
被基因组
DNA
污染。
如果
RT
阴性对照的
PCR
结
果也显示同样条带，
则需要用
DNase
I
重新处理样品。
*
在
PCR
反应中，
非特异的起
始扩增将导致产生非特异性结果。
在低于引物
Tm 2
至
5
℃的温
度下进行退
火，降低镁离子或是目的
DNA
的量将减少非特异性结果的产生
。
*
由于
m
RNA
剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的
RT-PCR
结果。
4.
产生弥散（
smear
）条带
*
在
PCR
反应体系中第一链产物的含量过高<
/p>
*
减少引物的用量
< br>*
优化
PCR
反应条件
/
减少
PCR
的循环次
数
*
在用
D
Nase
处理被
DNA
污染的
RNA
样品时，
其产生的寡核苷酸片段会产生非
特异性扩增，
一般会显示为弥散背景。
5.
产生大分子量的弥散条带
*
大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产
生的
*
对于长片段的
PCR
，建议将反应体系中
cDNA
< br>的浓度稀释至
1:10
（或
1:
100-1:200
）
6.
在无反转录酶的情况下，对照
R
NA
获得扩增结果
*
通常是由于对照
RNA
中
含有痕量
DNA
而导致的。
由于进行体
外转录时不可能将所有的
DNA
模板消除。建议可将第一链
cDNA
稀释
1:10
、
1:100
、
1:1000
倍以消除
DNA
污染所造成的影
响。
*
有可能是引物二聚体的条带
7.
扩增产物滞留在加样孔中
*
有可能是由于模板量过高而导致
PCR
结果产生了高分子量的
DNA
胶状物。
建议将第一链结
果至少稀释
100
倍再进行二次扩增。
*
另外，在二次
PCR
时使用的退火温度如果比引物的
Tm
值低
5
℃，可以将
退火温度适当增
高或进行热启动以提高特异性。
8. SS
Ⅲ与
< br>SS
Ⅱ有何不同？
*
具有更高的热稳定性（达
50
℃）
*
具有更长的半衰期
（达
220
分钟）
< br>*
对
PCR
无抑制
*
干冰运输
*Tdt
活性更低
9.
为什么有人更喜欢用
SS
Ⅲ而不是
ThermoScript
？
Ther
moScript
如果保存不当会引起活性很快降低，
SS
Ⅲ则更稳定。
10.
为什么使用基因特异性引物（
GSP
）？
GSP
在扩增低丰度的转录本时是最好的。
OligodT
引物建议用于高质量
RNA
及全长转录
本的
逆转录；随机引物用于
mRNA
片
段的逆转录。
11.
什么情况下需要使用
RNase
H
？
在
第一轮
PCR
中
RNA/DNA
杂合体不能正常变性时
12.
根据不同的目的选择不同的系统：
目的
建议
R
T
与
PCR
使用不同的引物
或需要灵活选择
PCR
DNA
聚合酶
两步法
RT-
PCR
系统
高灵敏度
一步法或两步法
RT-
PCR
系统
高特异性
含有适当的
DNA
聚合酶的两步法
RT
-PCR
系统
或具有高保真
Platinum
Taq
酶的一步法
RT-
PCR
系统
高保真度
含有
Pfx
Taq
酶的两步法
RT-
PCR
系统
长的反转录结果
通常使用两步法
RT-
PCR
系统可达到最佳结果
含
Elongase
酶的一步法
RT-
PCR
系统
二、
Generacer
1.
如何针对
< br>Generacer
试剂盒设计基因特异性引物（
GSP
）？
使
用
5’
或
3’RACE
试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点
要求：
*50-70
％的
< br>GC
含量，以提高引物熔点（
Tm
）
*23-28
个碱基长度，以提
高引物特异性
*
降低
3’
端
GC
含量，将引物非特
异性结合的可能性降至最低
2.
为什么得不到
RACE
产物？
*
加入
Hela
对照
*
低质量的
RNA
模板
*
逆转录失败，
SSII
和
SSIII
非常适用于长模板
cDNA
的合成
*
目的基因丰度太低，可以通过提高
PCR
的循环
次数来解决，建议使用巢式
PCR
*
目的基因没有表达，可以通过使用两条
GSPs
来分析
cDNA
中是否含有目的基因
*
目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用
Gen
eRacer
试剂盒中的
Oligo
dT
来得到全长
cDNA
，使用随机引
物或与模板的
5’
端尽可能近的
GSP
进行
PCR
。
*cDNA
模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化<
/p>
PCR
反应参数及反应体系；降低
退火温
度；
使用
5-10
％的
DMSO
帮助通过高
GC
含量
区；
使用高保真度和高延伸能力的酶进
行
PCR
反应。
3. RACE
的
PCR
结果有杂带
RACE
PCR
杂带或非特异性
PCR
条带可能
是由于以下原因：
*GSP
与其他<
/p>
cDNA
的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
*GeneRacer
引物和
cDNA
的非特异性结合会导致产生一端带有
GeneRacer
引物序列的
PCR
产物。
*RNA
降解。
*PCR
管或试剂污染。
注意：杂带一般是因为没有优化
PCR
条件，可以
加入阴性对照来确定。
4.
得不到全长的
5’RACE
PCR
产物
*CIP
反应后的
RNA
降解产生
了新的带有
5’
磷酸的断裂模板，可以同
GeneRacer RNA Oligo
连
接。一定要小心
操作，保证
RNA
无降解。
*CIP
脱磷酸不完全，可以增加反应中
CIP
的量或减少
RNA
的量。
*PCR
产生了杂带，并不是真正的连接产物，可
以使用上述建议优化
PCR
。
二、
Generacer
1.
如何针对
< br>Generacer
试剂盒设计基因特异性引物（
GSP
）？
使
用
5’
或
3’RACE
试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点
要求：
*50-70
％的
< br>GC
含量，以提高引物熔点（
Tm
）
*23-28
个碱基长度，以提
高引物特异性
*
降低
3’
端
GC
含量，将引物非特
异性结合的可能性降至最低
2.
为什么得不到
RACE
产物？
*
加入
Hela
对照
*
低质量的
RNA
模板
*
逆转录失败，
SSII
和
SSIII
非常适用于长模板
cDNA
的合成
*
目的基因丰度太低，可以通过提高
PCR
的循环
次数来解决，建议使用巢式
PCR
*
目的基因没有表达，可以通过使用两条
GSPs
来分析
cDNA
中是否含有目的基因
*
目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用
Gen
eRacer
试剂盒中的
Oligo
dT
来得到全长
cDNA
，使用随机引
物或与模板的
5’
端尽可能近的
GSP
进行
PCR
。
*cDNA
模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化<
/p>
PCR
反应参数及反应体系；降低
退火温
度；
使用
5-10
％的
DMSO
帮助通过高
GC
含量
区；
使用高保真度和高延伸能力的酶进
行
PCR
反应。
3. RACE
的
PCR
结果有杂带
RACE
PCR
杂带或非特异性
PCR
条带可能
是由于以下原因：
*GSP
与其他<
/p>
cDNA
的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
*GeneRacer
引物和
cDNA
的非特异性结合会导致产生一端带有
GeneRacer
引物序列的
PCR
产物。
*RNA
降解。
*PCR
管或试剂污染。