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PCR
的一般流程
（以
Taq
DNA
聚合酶为例）
一、
试剂和仪器
1
、
仪器：
PCR
仪、
移液器、
离心管和枪头
（
12
1
℃灭菌
20min
，
烘干）
、冰盒、板架、离心机。
2
O
：三蒸水
121
℃灭菌
20min
，
4
℃保存；
：含
Mg
，
10
×，
-20
℃保存；
：
保存液为
25mM
，
使用前用
ddH
2
O
稀释为
2.5mM
并
分装，避免污染，
-20
℃保存。
5.
引物：引
物干粉在溶解前先
12,000rpm
离心
2min
，再
用
ddH
2
O
溶解至
10
μ
M
，
涡旋震荡使其充
分溶解，
-20
℃保
存；
6.
模板。
2+
DNA
聚合酶：
-20
℃保存。
二、
实验准备
1.
预订
PCR
仪，填写好使用时间；
2.
制冰；
3.
将所需试剂解冻、混匀、瞬离，置于冰上，模板要放在
精选
冰上解冻。
三、
步骤：
1.
设计实验，认真阅读相关试剂说明书。
2.
将离心管置于冰上，
按照如
下体系加入样品。
加样顺序
为：
ddH
2
O
→
Buf
fer/dNTP/
引物
/
模板。
Taq
DNA
聚合酶反应体系（
25
μ
L
）
试剂
ddH
2
O
Buffer
（
Mg
，
10
×）
dNTP
（
2.5mM
）
2+
用量（μ
L
）
18.375
μ
L
2.5
μ
L
2
μ
L
引物
（正向和反向，
10
μ
M
）
各
0.5
μ
L
模板
DNA
10
~10
copies
0.125
μ
L
2
5
Taq
DNA
聚合酶
*
*
注意：
加酶之前将酶拿出放冰上，
使用完立即放回冰<
/p>
箱。
3.
在离
心管盖上写好每个样品的编号，瞬离。
4.
< br>设置好
PCR
程序，
待反应温度
达到实验需要时，
将样品
放入
PCR<
/p>
仪，尽量放在中央的孔。
精选
5.
将
试剂放回原处，移液器调回最大量程，整理实验台。
6.
反应结束后，及时停止
PCR
程序（不要停
在
4
℃太久）
，
取出样品，关好
PCR
仪。
四、
其它注意事项：
1.
正确使用移液器、离心机和
PCR
仪；
2.
手或移液器不要接触反应管或试剂瓶、
管的内壁、
盖内
侧；
3.
不使用枪头时，盖好枪头盒盖；
4.
枪头只能使用一次；
5.
合理设计实验，
使用适当的阴性对照很重要，
如：
使用
不加
DNA
的材料进行
PCR
扩增，以证明
缓冲液或其他试剂中
是否存在任何可影响
PCR
的污染物；
6.
如果一次实
验需做多管样品，尽量先配制
mix
，由于存
< br>在液体混合后的体积变化和挂液，计算
mix
用量要比实
际管
数多一些；
7.
反应在
PCR
仪进行期间，
最
好能检查一下程序是否在正
常运行，及时发现异常。
3.2
移液器的使用方法
1.
调节量程：轻轻旋转量程调节圈，注意不要超过量程。建
精选
议从高到低调节量程，
必要时，
可旋转量程调节圈稍超过
所需数值，再向回旋转，
移液可以更准确。
2.
装配枪头：轻
轻按压，将枪头盒上的枪头装配到移液器。
3.
吸液：按下操作键至一档（设定体积）
，将枪头垂直浸入
液体约
4mm
；让操作键慢慢复位，此过程中保持枪头浸入
深度，
防止吸入空气；
将枪头慢慢移出
液面，
并确保枪头
外壁无残留液体。
（
建议每个新枪头先经过一到三次的吸
液和放液来润湿，
有助于提
高移液准确度。
吸取大体积液
体时，将枪头保持浸入状态约
3
秒钟，再移液。
）
A
B
图
3.2.1
移液器的吸液（
A
）和放液（
B
）
4.
放液：
将枪头倾斜地紧贴管壁，
将操作键慢慢按向一档
（设
定体积）
，等待，直到不再有液体流出；将操作键按向二
< br>档（吹液）
，将枪头完全排空；仍然按住操作键，在管壁
上擦拭枪头；
在管外，
慢慢让操作键复位；
按下脱卸键卸
掉枪头。
精选
5.
其它注意事项：
（
1
）轻拿轻放，使用后调回最大量程；
（
2
）保持移液器洁净。
（
3
）与水
有很大物理性差异的溶液，或在移液器枪头和液
体间存在很大温差的溶液，
可能会导致移液不准，
要注意
检查移液体积。
3.3
PCR
反应原理及过程
3.3.1
反应原理
PCR
技术的基本原理类似于
DNA
的天然复制过程，其特
异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，是利用
DNA
在体外摄氏
95
°高温时变性会变成单链，
低温
（经常是
60
°
C
左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温<
/p>
度至
DNA
聚合酶最适反应温度（
72
°
C
左右），<
/p>
DNA
聚合酶
沿着磷酸到五碳糖
(5'-3')
的方向合成互补链（图
3.3.
1
）。
基于聚合酶制造的
PCR
仪实际就是一个温控设备，能在变性
温度，复性温度，延伸温度之间很
好地进行控制。
3.5.2
反应过程
PCR
由变性
--
退火
--
延伸三个基本反应步骤构成（图
3.3.2
）：①模
板
DNA
的变性：模板
DNA
经加热至
95
℃左右
精
选
一定时间后，使模板
DNA
双链或经
PCR
扩增形成的双链
DNA
解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准
备；②模板
DNA
与引物的退火（复性）：模板<
/p>
DNA
经加热变
性成单链后，
温度降至
55
℃左右，
引
物与模板
DNA
单链的互
补序列配对结
合；③引物的延伸：
DNA
模板
--<
/p>
引物结合物在
Taq
DNA
聚合酶的作用下，以
dNTP
为反应原料，靶序列
为模
板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模
板
DNA
链互补的半保留复制链，重复循环变性
--
退火
--
延伸
三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又
可成为下次循环
的模板。每完成一个循环需
2
～
4
分钟，
2
～
3
小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
精选
图
3.3.1
PCR
反应原理
精选
图
3.3.2
PCR
的基本步骤
3.4
几种常用
< br>PCR
方法
3.4.1
标准
PCR
（
Standard
PCR
）
该方法适用于扩增小于
3000bp
的
DNA
序列。
建议体系：
Reaction Volume
100
μ
L
精选
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