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Ensembl
data bank
甲基化
测序
BSP
法
的那个黑白点状图
（黑表示甲基化、
白点表示非甲基化）
是
怎么做出来的呀
上
用
BiQ
ANALYZER
软件，免费的可以下载，安装需要最新的
ja
va
程序
，关于后续的一些步骤，我看了一篇国内的硕士论文，如下：
2.2.1.4.6
连接反应产物的转化
(l)
每个连接反应准备
1
个含有氨节青霉素的
LB
平板，涂板前半小时
将平板从冰箱
中取出平衡至室温。
(2)
离心使连接反应内容物汇集到管底，吸取
10ul
连接反应产物加到置于冰上的
1.5ml
离心管中
.
(3)
将冻存的
JM109
高效率感受态细胞从一
70
℃冰箱中取出，放置在冰浴直至融化
(
大概
5<
/p>
分钟
)
，轻轻振动离心管使之混匀。
(4)
向步骤
2
准备的每个转化管中加入
50ul
感受
态细胞。
(5)
轻轻振动小管混匀，
冰浴
30
分钟。
(6)
在精确的
42
℃水浴中热击
45
一
50
秒
(
不要振动
)
。
(7)
迅速将管子移到冰浴中，使
细胞冷却
2
分钟。
< br>(8)
每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的
200
ulLB
培养基，
(9)
在
37
℃振荡培养
(15
0rpm)1
小时。
(10)
将每个转化培养基
200ul
涂到
LB/
氨苄
/IPTG/X-Gal
平板上。
(11)
将平板
于
37
℃恒温箱中过夜培养
(16
一
24
小时
)
。
2.2.L4.7
阳性克隆筛选
从培养箱中取出平板，置于
4
℃冰箱使蓝色
充分显现。挑取白斑菌落到
5mLB
培
基，
37
℃摇床上培养过夜。吸取
lml
菌液送测序，引物为通用引物
M13
。
进入丁香园，
是从做
MSP
开始的。
从对
DNA<
/p>
甲基化的一无所知到
MSP
实验成功，<
/p>
经历了
很多艰难，同时也收获得了不少经验。从丁香园的帖子可以
看出，近几年来，国内对
DNA
甲基化的研究在逐年增加，战友
们在实验中遇到的困难也不少。在这里谈一下对
MSP
,
及
BSP
的一点体会，希望能对新手们有所帮
助，也请老手们批评补充。
亚硫酸
氢盐转化和
PCR
扩增是
MSP
,BSP
的两个基本步骤。亚硫酸氢盐转化，估计现在做
手工修饰的也不多了，试剂盒能够很方便的帮我们解决问题。但
PCR
中的引物设计，现在
可能还是个难题。看到很多帖子里提到的引物都是
来源于文献的，但事实上在很多情况下，
我们是没法找到现存引物的，因此掌握
BSP
,MSP
引物的设计就显得非常必要了。
BSP
，
MSP
引物设计的一个最大问题在于亚硫酸氢盐的转化使得模板
的序列复杂性大大降
低，
而且经常产生
T
或
G
或者富含
GC
片段交替出现的序列。
这个会使引物选择变得困难。
因此，往往我们需要设计巢式引物来解决这个问题。
BSP
,MSP
引物的设计，除了要遵循引
物设计的基
本原则外，还要注意一下一些规则：
（
1
）
引物结合位点应该在原始序列中包含
4
个以上胞嘧啶来确保转化后的
DNA
的特异性。
（
2
）
BSP
引物不应包含
CG<
/p>
二核苷酸，长度在
25
－
30bp
较为合适；
MSP
引
物因为往往
具有较高的
GC
比，长度应
适当缩短。
（
3
）扩增片段一般认为不要超过
650bp
，以保证
PCR
的效率。
（<
/p>
4
）
对于
MSP
引物，
应该包含
3
－
5
个潜在可甲基化位点，且引物的
3
端应该是一个潜在
的可甲基化胞嘧啶，以得到最大化的特异
性。
（
5
）
MSP
中，
U
引物与
M
引物应该具有接近的
TM
值。
一些网站
提供了
BSP
,MSP
引物的免费设计
服务，
本人也尝试在网上设计过，
感觉里面算法
过于简单，无法得到满意的引物。在实验中，本人采用了
premier5
设计的引物。具体做法
如下：
（
1
）获取感兴趣的启动子序列，将序列中非
CG
二核苷酸的
C
全部转化为
T
（
word
可实
现此功能）
；
（
2
）序列载入
pr
emier5
，按上述原则筛选引物。
（
3
）
MSP
引物中的一条往往是由需要确定，因此我们可以直接利用
premier5
筛选其互补
引物。
MS
P
引物要求的苛刻性常常使得引物的设计变得不可能，在满足规则（
4
）的情况下，可设
计外侧
BSP
引物，利用
BSP
产物进行
MSP
.
BSP
,MSP
引物设计的另一个困难在于无法进行全基因组的
blast
，
这也让巢式扩增显得更加
必要。
做了点
甲基化研究，
从头下来，
也有一点点体会。
也看了院子里不少牛人的新的体会。
本人
将每一个步骤的具
体操作、
每个操作的具体注意事项和心得进行初步总结，
慢慢叙
来，
抛砖
引玉，欢迎拍砖。
做到现在，有成功的喜悦，也有失败痛苦，且行且歌，总得来
说，
BSP/MSP
，想说爱你不
容易
。
如有时间，想谈谈：
BSP/MSP
引物设计；基因组海量甲基化数据分析；
< br>MSP
设计及操作；
当前
MSP
的研究进展，等等吧
……
1.
确定目的基因后，登陆一下网址：
/
2.
选网页左边的：
Genome
Browser
后，进入基因检索界面
3.
在
Assembly
下拉菜单选择：
Mar.2006
4.
在
position or search term
输入基因名称，如
APC
后，
submit
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