PCR过程问题全解

PCR

反应的灵敏度及特异性。

热启动

PCR

是除了好的引物设计之外，提高

PCR

特异性最重要的方法之一

PCR

增强剂

包括甲酰胺，

DMSO

，甘油，甜菜碱等，能构降低熔解温度 ，从而有助于引物退火并辅助

DNA

聚合酶延伸通过二级结构区 。

PCR

扩增过程中常见的问题及解决方法

PCR

技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简 便、易于自动化，因此在

临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。

目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展

PCR

研究 用应用工作。

PCR

技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的 单位都能较顺利地上

马，但毕竟

PCR

技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。

在

技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，

更甚至会得到与事实完成相反的结果。

为

了使我们能够顺利地开 展

PCR

工作，更好地发挥

PCR

技术的工具作用，我们根据多年来

PCR

工 作总结的经验，

对

PCR

扩增过程中经 常出现的一些问题进行简要的总结，

提供给广大科研

工作者作为 参考，抛砖引玉，不足之处欢迎指正。

一、

假阳性扩增

在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，

这

是扩增系统受 到污染时最典型的一种表现，

需仔细检查，

排除污染源，

一般应从以下步骤着

手：

⒈ 试剂污染：

< br>厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、

贮存过程中受到污染。

检测方法，

可

按试剂盒说明书将试剂分装好，< /p>

直接置于

PCR

仪中扩增

（不加阴性对照，

可加适量蒸馏水）

，

便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。

⒉ 实验室污染：

这是最常见的污染源，

PCR

技术可以在几个小时内将模板中某些特 异性序列扩增到

数百万倍以上，

扩弗产物可能在电泳等过程中污 染移液器、

操作台或随着蒸发所形成气溶胶

而污染整个实验室。 扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。

判断方法：

可以将实验中最关键步骤如试剂分装、

样品处理等转移到一个新的环境 中或转移

到超净工作台中完成。当然，所用的移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。 解决方法：

实验室污染是

PCR

扩增过 程中最易出现的现象，

而且一旦出现污染，

消除污染源又极其困 难，

往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，

所以应该以 预防为主，

实验过程中严格遵守

实验基本要求，

样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，

最好能在两个房间进行。

扩增前处

理所用的移液器及扩增后点样用的移液器应严格地分开，不可互换。

PCR

室应保持良好的通

风、清洁、最 好能专用。

⒊ 采样污染：

在实验过程中，

有时会出现一批结果 阳性率很高，

一批结果阳性率又下降很多，

如此反

复，

这种现象大都是由于采样时污染所致，

一般来讲 正规试剂生产厂家，

其试剂出厂时都要

经过严格的质量检测、批 间，特别是批内差异都极小，不致出现如此明显的反复，

这种现象

主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。

PCR

扩增 非常敏感，而一般实验室对重复

使用的试管所进行的洗涤方法往注不能去除痕量

DNA

，这些痕量

DNA

便成为

PCR

模板，出现

阳性扩增结 果，

由于采样试管受污染程度不一，

所以出现忽高忽低的现象解 决方法建议使用

一次试管及吸咀取样。

二、

假阴性扩增：

如果连续几次扩增结果都是阴性，

或 已知阳性样本出现阴性扩增结果，

一般认为这是假

阴性，出现这 现象有以下几种原因：

⒈ 仪器故障：

出现全阴结果，

首先考虑到仪器运转 是否正常。

正确判断仪器的工作状况，

是排除假阴

性其它原因的基础，仪器运转是否正常是

PCR

扩增 最关键的步聚之一。判断仪器是否正常，

首先要测定加热体的温度是否准确，波动范围是 否答合要求，各孔之间差异是否符合要求，

PCR

扩增往往对仪 器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度，如果误差太大，势必出现

假阴性。必须注 意的是不能过信名牌，我们经常发现一些名牌机器温度差异高达二度以上。

⒉ 试剂失效或无效：

便可对试剂进行检测。

首先要 了解试剂是否超过有效期，

试存放方

法是否达到要求，如果试剂 盒在有效期内，贮存方法是正确，

那么就应该仔细、慎重地判断

试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。

可以用已知阳性样本，

或 试剂盒提供的阳性对照，

严

格按说明书操作扩增一次，然后把扩 增产物用双蒸水稀释

1000

倍，作为模板进行第二次扩

增，

判断结果，

如果是阴性说明试剂无效或不 合格，

如果结果阳性那么可用以下方法判定试

剂的灵敏度。

⒊ 试剂的敏感度：

有时试剂检测的阳性率偏低，

所谓阳性率偏率就是指出现假阴性结果，

这种现象往往与

以下三种因素有关：

①试剂质 量不过关；

②操作方法不规范；

③主观判断标准不科学。

对于

试剂质量及操作是否正确这两点是比较容易检查并合理改进。

这里着重提一下：

目前经常碰

到的一些不科 学概念，

我们习惯用某些样本应该阴性，

某些样本应该阳性，< /p>

或简单地以阳性

率。

主观概念判断试剂是 否合格这是极不科学的主观推论。

如对乙肝血清的测定，

就不能 用

抽象的阳性率应该是

60

％或

20

％这样的概念来判断，同样也不能用“二对半”的结果评判

“PCR

结果”，这是因为“二对半”与“PCR”是两种完全不同的 检测方法，其检测结果的

意义有质的区别，

它为医务人员提供的 信息是大不相同的，

更加之所使用的“二对半”试剂

是否能作为 质量评价标准仍待考定。目前世界上较公认的标准品只有雅培的“两对半”试

剂，国内的 “二对半”试剂据卫生部抽查资料表明，一度合格率在

50

％以 下，怎么可能作

为质量评定标准呢！

对试剂敏感度的评价标准应 该使用下述方法科学地评价，

首先选择标准

样本如

HBV

全序列质粒，

标准阳性血清，

结核菌菌体等用合适的介质如血清、

痰液等进行有

限稀 释按

1

：

10

、

1

：

100

、

1

：

1000

、

1

：

10000

< br>如此逐步提高稀释度价其试剂的敏感度，一

般认为如果标准阳性乙肝的血清用正常 血清稀释

10000

倍以上，

结核菌每 毫升中在

100

个左

右仍能测出阳性结 果时，

试剂的敏感度是足够的，

判断试剂的灵敏度是足够的，< /p>

判断试剂的

灵敏度后仍需判断试剂的检测覆盖，

< br>因为病原微生物有不同的型或变异株，

合格的试剂不应

漏 检。

最后还要判断试剂盒的异性，

一般的实验室可以用不同病原 体的样本按说明书操作来

判断其对其它病原体扩增时是否也有阳性出现，

其特异可达到怎样的精度，

经过以上三个方

面的研究便 可以科学地判断试剂的质量。

三、

扩增产物拖尾

有时扩增产物电泳后出现一个个萤光团（

Smear

现象）或出现一连串的条带，这些种现

象主要与 以下几种因素有关：

⒈ 扩增系统不完善：

这种现象表明出现非特异性扩增，

而 产生非特异性扩增与扩增系统中镁离子浓度、

引物

浓度、

DNTP

浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。另外也 可以适当提高退

火温度，从而提高扩增特异性。

⒉ 模板处理方法不完善：

PCR

扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复 杂的，如对

PCR

主

要成分之一

DNA

聚合酶的影响因素很多，

这些因子是怎 样作用于聚合酶，

其作用机制至今仍

不清楚，

< br>因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，

也可能导致非特异扩增。

一般分泌物样本，

应取脱落细胞为主，避免采集过多的脓性分泌物，痰液样本一 定要充分液化，等等。

⒊ 引物设计不合理：

引物设计应遵循以下几个原则。首先，引物一般应由