-反映
苏云金芽孢杆菌的研究
摘要
<
/p>
苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛、研究最深入、生产量最大的微生物
杀虫剂。目前已发现多种
Bt
亚种或血清型对害虫具有杀虫
活性
,
同时也发现了一
些新的杀虫晶体
蛋白，通过纯化得到高效的杀虫晶体蛋白也是目前研究热点之
一。本文简要介绍了
Bt
的发展历史、晶体蛋白的纯化及在杀虫
方面的一些应
用。
关键词
苏云金芽孢杆菌、历史、伴孢晶体、杀虫
苏云金杆菌
(
Bacillu .th
uringiensis
，简称
Bt)
是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为
昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形
成短链。在芽孢形成期
可产生具有杀虫活性的伴孢晶体
,
且伴孢晶体
(
原毒素
)
对鳞翅目或双翅目等多种
昆虫具有毒杀活性
< br>[
15]
。
苏云金杆菌是一种应
用广泛的绿色环保型微生物杀虫剂，
全世界年产值已突破
1
亿美元
[1]
。
自
20
世纪
60
年代实现工业化生产以来
,
已成为
世界
上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂
,
每年
以
20%
的速
度增长
< br>[2,3]
。苏云金杆菌杀虫剂的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等问题都<
/p>
待解决，关于苏云金芽孢杆菌的研究都将继续进行。
1
Bt
的发展历史
1901
年，
日本学者石渡繁胤
(Ishiwata)
从虫尸体液中分离出
苏云金杆菌猝倒变
种
(
giensis
)
成为苏云金杆菌研究的起点
[4]
。
1911
年，
Berliner
发现一杆菌，并详
细
描述了
该
菌的形
态
< br>和培养特
征，定
名为苏云金
杆菌
(
giensis
)
< br>，指明苏云金杆菌含伴孢晶体
(
Paraspora
crystl
)
。
1938
年，
苏云金杆菌商品化，
用于防治地中海粉螟。
20
世纪
5
0
年代许多国
家进行了商业性生产。从发现该菌至今已有整整<
/p>
105
年历史
,
世界上有超过万篇
的研究报道
,
涉及生
物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传
学、产品化和安全性
,
包括近年来的转基因植物等诸多方面
[5]<
/p>
。
1953
年
，
Hannay
第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有
关，并和
Fitz-James
于
19
55
年证实，
伴孢晶体是一种蛋白质。
1981
年，
Schnept
和
Whiteley
首次将
HD21
菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，
并得到表达。
用血清学技
术进行
Bt
的鉴定和分
类始于
20
世纪
60
< br>年代。
我国对苏云金芽孢杆菌的研究和应用起步较晚，
但发展迅速，据统计，在在
70
年代，我国苏云金杆菌制剂年产
量大
1000
吨以上，并且部分产品用于出口。
1992
年联合国“世界环境和发展大会”
在巴西的召开促进了全球生物防治
的发展，推
进了苏云金杆菌制剂产业化进程。世界上许多科学家致力于
Bt
的研
究，并作出卓越贡献，时至今日，
Bt
在农药上所占的比例仍处于劣势，许多问
题依然有待解决。
2
苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体的纯化方法
2.1
等密度梯度离心法
等密度梯度离心法是利用密度的差
异将伴孢晶体与杂质分离
,
获得纯品的方
法。常用的密度试剂有蔗糖
[6]
、碘化密度梯度介质
(
Renografin
、
< br>Metrizamide
、泛
影葡胺
)
[7]
、人工聚合蔗糖
(
Ficoll
)
、碱金属盐
< br>(
CsCl
、
NaBr
)
、硅溶胶
(
Ludo
x
)
[8]
等。
其中蔗糖密度梯度离心方法简单
,
成本较低
< br>,
但蔗糖溶解在水中的密度为
1.3,
< br>分离
孢晶混合物
(
平均密度为<
/p>
1.31)
时不理想。
碘化密度梯度介质
渗透压低
,
不易破坏分
离物。溴化钠作
为一种理想的梯度介质得到了广泛的应用
,
其价廉、粘度低
,
且有
足够大的密度。等密度梯度离心法获
得的伴孢晶体纯度较高
,
缺点是产量较低、
试剂及实验条件要求比较严格。
2.2
离子交换分离法
离子交换分离法是利用离子交换树
脂上的可交换离子发生的变换反应进行分
离和纯化
[9]
。
该方法设备简单、
操作方便、
分离速率快且效率高
,
广泛应用于化工、
医药、食品、造纸和冶金等领域。离子交换反应是可逆平衡反应
,
为使反应不断
地朝反应正方向进行
,
需采取不断分离产物的操作
,
通过借助离子交换柱
进行动态
离子交换来达到这个目的。由于酶和蛋白质都有电解质性质
,
可用离子交换法进
行分离提纯。吴洪福
< br>[10]
等通过
Resource
Q
进行阴离子交换层析纯化
Cry8Ca2
蛋
白；
韩岚岚等
[11]
通过
HiTrap
Q
柱层析分离纯化
Bt Cry
毒素及
原毒素蛋白
;Bietlot
等
[12
]
用
40%(
质量体积比
)
的硫酸铵沉淀
,
再对缓冲
溶液透析后分离纯化毒素蛋
白。
2.3
液体双相分离法
液体双相分离法利用互不相溶的两种液体对晶体和芽孢的亲和性不同
(
即晶体、
芽孢表面特性不同
)
而达到分离目的。该方法具仪器简单、试剂便宜、产量高的
优点，但纯度较低，
操作复杂。常用的有三种液体双相体系
,
一是聚合物
-
聚合物
双相体系
,
如聚乙二醇
(PEG)-
葡萄糖
-
水、聚乙二醇
-
硫酸葡
聚糖钠和聚丙烯酰胺
-
葡聚糖钠
;
二是聚合物
-
盐体系
,
如聚乙二醇
-
磷酸盐
-
水
;
三是盐水与有机溶剂
组成
的液体双相体系，如三氟三氯乙烷
-
硫酸钠、氯仿
-
水等。
2.4
等电点沉淀法
由于氨基酸存在三种形
式即带正电荷、
带负电荷、
两性离子，
在等电点时氨基酸
溶解度最低，利用此特点制备伴孢晶体纯品，操作简单、制备量大且工
作量小。
2.5
碱裂解法
苏云金芽孢杆菌产生的伴孢
晶体为由
cry
基因和
cyt
基因所编码的碱溶性蛋白
,
在
< br>pH
值高于
9.5
时
,
大多数的
cry
毒素和
cyt
毒素溶解
,
少数
pH
值为
12
时完全溶
解。碱裂解法是选用
pH
值
9.6
的碳酸钠缓冲溶液使大多数的蛋白质从菌体中溶<
/p>
出得到伴孢晶体纯品
[16]
。
2.6
高速离心法
高速离心法是利用惯性离心力和物
质的沉降系数或密度的不同而进行分离提
纯的。该方法适用于固体颗粒很小、液体粘度很
大及难于过滤的悬浮液
,
也适于
那些忌
用助滤剂或助滤剂使用无效的悬浮液的分离
[13]
。
该方法具制备时间缩短、
试剂便宜的优点
,
且得到的伴孢晶体纯度可达
99%
以上
,
是大规模生产中应用最广
泛的方法
[14]
。
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