burner蛋白酶抑制剂基因及转基因植物研究进展

电荷、

等电点等性质，

< br>单独或联合使用几种如梯度洗脱、

分子筛层析、

亲和层析 、

电泳等经典技术，

达

到分离和纯化的 目的。但不同植物蛋白酶抑制剂的分子量、电荷等特性有差异，

在分离不同植物蛋白酶抑 制剂时所选用的层析介质、

缓冲液的

pH

和浓度大小、

电

泳时的分离胶和浓缩胶的浓度和交联度都有差 别，

这些均需要通过深入了解不同

植物来源蛋白酶抑制剂的特性 设计相应的试验技术。

就目前已提取的蛋白酶抑制

剂而言，

大多数蛋白酶抑制剂都具有耐热性和相对分子量小的特点。

从水稻种 子

中提取的水稻巯基蛋白酶抑制剂，

其分子质量为

12

．

0

ku

在

100

℃下温浴

30

min

，

其 抑制活性没有改变；

曾仲奎等分离水稻种子获得的巯基蛋白酶抑制剂也具有该

Abe

等试验结果的可靠性，而后又 分别从玉米、百合、小麦等农作

物中分离到了巯基蛋白酶抑制剂，

获得了一致的试验结果。

从防己科植物波叶青

牛胆分离到一种 胰蛋白酶抑制剂

(TCTI)

，其相对分子量为

10

．

0 kd

，在

100 oC

下加热

60

min

，仍保持

93

％的抑制活性；王从海芋、从花生中均 分离到胰蛋白酶

抑制剂，

并证实了丝氨酸蛋白酶抑制剂也具有上 述特点。

基于蛋白酶抑制剂的特

点，

在 其分离时大多数研究者采用对蛋白酶抑制剂提取液加热的方法以除去大量

不耐高温的杂蛋 白，

从而极大地简化了试验步骤。

为获得较纯的蛋白酶抑制剂样

品，

目前通过

HPLC

、

RP

．

HPLC

FPLC

色谱研究方法越来越多，

极大地提高了样品

的纯度，为获得蛋白酶抑制剂的结晶和研究其空间结构及特 性提供了技术保障。

有关蛋白酶抑制剂活性测定，

传统的方法主 要利用酶和抑制剂作用的动力学测定

法，

但该方法的缺点是花费 时间长，

试验条件不易控制，容易造成试验误差。

近

新的快速、

准确的 鉴定方法应运而生，

应用一种

快速聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定了蛋 白酶抑制剂，应用

SDS

—

PAGE< /p>

一明胶电泳检测

了植物蛋白酶抑制剂。

该 方法主要根据特异植物蛋白酶抑制剂抑制靶蛋白酶的作

用从而阻止水解的原理，

借助明胶一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，

经蛋白酶水

< br>解后，

用考马斯亮蓝染色；

是一种简便、

直观、

灵敏的检测蛋白酶抑制剂活性的

方法，

该方法还可以进行大量样品的筛选工作，

极大地加快了蛋白酶抑制剂的活

性测定。

另一种获得植物蛋白酶抑制剂抗虫基因的途径是利用目 前已有的植物蛋

白酶抑制剂基因序列，

比较其同源性，

找出保守序列，

在此基础上设计引物、

扩

增和测序，

同时在构建目标材料

CDNA

文库的基础上，

通过基因序列的比对，

查找

目标材料中是否存在该植物蛋白酶抑制剂基因的序列，

在此基础 上，

通过相应的

分子生物学技术扩增出目标材料中蛋白酶抑制剂 的序列片段，找出基因全长的

CDNA

序列，

< br>然后在一定的载体上扩增和表达，

得到目的蛋白序列，

最 后鉴定其功

能。

三

蛋白酶抑制剂转基因作物（

GMO

）发展进程

自

1987

年首次将豌豆蛋白酶抑制剂

(

Cow

pea

Tr

ypsin

Inhibitor,

CpT

I)

基

因转入烟草并获得抗虫植株以来

,

有关利用

PI

基因获得抗虫

GMO

作物的研究取< /p>

得了很大的进展。

迄今为止

,

自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂

:

丝氨酸蛋白酶

抑制剂、

巯基蛋白酶抑制剂、

金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂。

其中只有

前两者对 昆虫的生长和发育有明显的抑制作用

,

在抗虫

GMO

作物中应用较广。

丝

氨酸

PI

与抗虫

GMO

作物关系最为密切

,

因为大部分昆虫 肠道内的蛋白酶是丝氨

酸蛋白酶。

目前已有多种丝氨酸