boxers-鼎鼎大名
PCR
扩增常见问题及特点
PCR
产物的电泳检测时间
一般为
48h
以内，有些最好于当日电泳检测，
大于
48h
后带型不规则甚至消失。假阴性，
< br>不出现扩增条带。
PCR
反应
的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④
PCR
循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：
①模板中含有杂蛋白质，
②模板中含有
Taq
酶抑制剂，
③模板中蛋白质没有消化
除净，
特别是染色体中的组蛋白，
④在提取制备模板时丢失过多
，
或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻
底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程
出
了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：
需更换新酶，
或新旧两种酶同时使用
，
以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假
阴性。需注意的是
有时忘加
Taq
酶或溴乙锭。
引物：
引物质量、
引物的浓度、
两条引物的浓度是否对称，
是
PCR
失败或扩增条带不理想、
容易弥散的常见原因。
有些批
号的引物合成质量有问题，
两条引物一条浓度高，
一条浓度低，
造成低效率的不对称扩增，
对策为：
①
选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看
OD
值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮
度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做
PCR
有可能失败，应和引物
合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，
一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物
< br>应高浓度小量分装保存，
防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，
< br>导致引物变质降解失效。
④
引物设计不合理，如引物长度
不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+
浓度：
Mg2+
离子浓度对
PCR
扩增效率影响很大，浓度过高可降低
PCR
扩增的特异性，
浓度过低则影响
PCR
扩增产量甚至使
PCR
扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行
PCR
扩增采用的体积为
20
ul
、
30
ul
、
50
ul
。或
100 ul
，应用多
大体积进行
PCR
扩增，是根据科研和临床检
测不同目的而设定，在做小体积如
20 ul
后，再
做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对
PCR
扩增来说相当重要，如变性温度低，
变性时间短，极有可能出现假
阴性
;
退
火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模
板的结
合而降低
PCR
扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测
一下扩增仪或水溶锅
内的变性、退火和延伸温度，这也是
PCR
失败的原因之一。
靶序列变异：
如靶序列发生突变或缺失，
影响引物与模板特异性结合，
或因靶序列某段缺失
使引物与模板失去互补序列，其
PCR
扩增是不会成功的。
假阳性
出现的
PCR
扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行
PCR
扩增时，
扩增出的
PCR
产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需
重新
设计引物。
靶序列或扩增产物的
交叉污染：
这种污染有两种原因：
一是整个基因组或大片段的交
叉污染，
导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：
操作时应小心轻柔，
防止将靶序列吸入加样枪
内
或溅出离心管外。
除酶及不能耐高温的物质外，
所有试剂或器材
均应高压消毒。
所用离心
管及样进枪头等均应一次性使用。必要
时，在加标本前，
反应管和试剂用紫外线照射，
以破
坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染，
这
些小片段比靶序列短，
但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物
互补后，可扩增出
PCR
产物，而导致假阳性的产生，可用巢式
PCR
方
法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR
扩增后出现的条带与预计的大小不一致，
或大或小，
或者同时出现特异性扩增带与非特
异性扩增带。非特异性条带的出现
，
其原因：
一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形
成二聚体。二是
Mg2+
离子浓度过高、退火
温度过低，及
PCR
循环次数过多有关。其次是酶
的质和量，
往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，<
/p>
酶量过多有时也
会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计
引物。
减低酶量或调换另一来源的酶。降
低引物量，适当增加模
板量，
减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法
（<
/p>
93
℃变
性，
6
5
℃左右退火与延伸）
。
出现片状拖带或涂抹带
PCR
扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，
dNTP
浓度过高，
Mg2+
浓度过高，
退火温度过低，
循环次数过多引起。
其对策有：
减少酶量，
或调换另一来源的酶。②减
少
dNTP
的浓度。适当降低
Mg2+
浓度。增加模板量，减少循环
次数。
（
1
）
PCR
产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分
析扩增产物只有一条带，
不需要用凝胶纯化。
如可见其他杂带，
可能是积累了大量
引物的二聚体。
少量
的引物二聚体的摩尔数也很高，
这会产生高比例的带有引物二聚体的克
< br>隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
（
2
）如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
A.
涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落
，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B.
转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将
1ug/ul
质粒
1:100
稀释
,1ul
用于
100ul
感受态细胞转化。用
SOC
稀释到
1000ul
后，
用
100ul
铺板。
培养过夜，<
/p>
产生
1000
个菌落。
< br>转化率为：
产生菌落的总数
/
铺
板
DNA
的总量。
< br>铺板
DNA
的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。<
/p>
具体而言转化用
10ng DNA
，
用
SOC
稀
释到<
/p>
1000u
后含
10 ng DNA
，用
1/10
铺板，共用
< br>1 ng DNA
。转化率为：
1000
克隆
X10
（
3
次方）
ng
/
铺板
1 ng DNA ug=10
（
6
次方）
cfu/ ug
转化
pGEM-T
应用
10
（
8
次方）
cfu/ ug
感受态细胞
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C.
如用
pGEM-T
正对照，或
PCR
产物，
产生
>20-40
蓝斑（用指定步骤
1
0
（
8
次方）
cfu/ ug
感受态细胞）
，
表明载
体失去
T
。
可能是连接酶污染了核酸酶
。
T4 DNA
连接酶
（
M1801
，
M1804
，
M1794
）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的
T4 DNA
连接酶替换。
D.
用
p
GEM-T
或
pGEM-T Easy
载体，连接
pGEM-T
正对照，转化高频率感受态细胞（
10
（
8
次方）<
/p>
cfu/ug
）
,
按照指定的实验步骤，可得
100
个菌落，其中
60%
应为白斑，如产生
>20-40
蓝斑
,
没有菌落或少有菌落，连接有问题。
（
3
）对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么
问题？
A.
连接用室温保温
1
小时，能满足大多数克隆，为提高效率，
需
4
℃过夜。
B.
插入片段带有污染，
使
3`-T
缺失，
或抑
制连接，
抑制转化。
为此，
将插入片段
和
pGEM-T
正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，
插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量
的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使
pGEM-T
或
pGEM-T Easy
载体
3`-T
缺失。
C.
插入片段不适于连接。用凝胶
纯化的插入片段，因受
UV
过度照射，时有发生。
UV
过度
照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，
DNA
必需重新纯化。
D.
带有修复功能的耐热
DNA
聚合酶的扩增产物末端无
A
，后者是
pGEM-T
或
p
GEM-T
Easy
载体克隆所需。加
Taq D
NA
聚合酶和核苷酸可在末端加
A
。<
/p>
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