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煮沸法快速提取质粒以及
DNA
酶解
和琼脂糖电泳
【实验目的】
【实验原理】
【材料试剂】
【操作步骤】
【注意事项】
【思考题】
【选择实验】
一．
实验目的：
1
、
掌握质粒
DNA
分离，纯化的原理
2
、
学习煮沸法快速提取质粒
DNA
的方法
3
、
学习
DNA
的限制性酶切的基本技术
4
、
学习利用琼脂糖电泳测定
DNA
片段的长度
二、
实验原理
在基因工程中，
DNA
分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的
DNA
序列，
在一定的条件下切断双链
DNA
。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如
反应温度，缓冲体
系，离子种类与浓度，
DNA
的纯度和甲基化程度等。对
DNA
进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。
对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓
冲
液。
DNA
的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。
SDS
等杂质都会抑制限制性
内切酶的活性。
琼脂糖凝胶电泳是分离，
鉴定和纯化
DNA
片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料
-
溴化乙锭进行
染色，可确定
DNA
在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中
回收
DNA
条带，用于各种克隆操作。
琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范
围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长
度为
200bp
至近
50kbp
的
DNA
。长度
100kb
或更大的
DNA
，可以通过电场方向呈周期性变化的脉
冲电场凝胶电泳进行分离。
在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定
的电场下进行电泳。
DNA
分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。
DNA
分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，
碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。
三
．
实验材料和试剂：
1
．
菌种：
含
pUC18
的大肠杆菌
JM107
菌株。
2
．
化学试剂和溶液
（
1
）
LB
培养基：
NaCl 10g/l
酵母提取物
5g/l
胰蛋白胨
10g/l
氨苄青霉素
50 μ g/ml
（培养基灭菌后加入）
pH7.0
（
2
）
70%
乙醇（
-20
℃）及无水乙醇（
-20
℃）
（
3
）
STET
缓冲液（
pH8.0
）（
8%
蔗糖，
0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L
Tris
）
（
4
）
5%CTAB
（十六烷基三甲基溴化氨）
（
5
）
1.2M
氯化钠
（
6
）
TE
缓冲液（
10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA
）
（
7
）
电泳缓冲液（
50XTAE
）
Tris 242g
，
冰醋酸
57.1ml
，
EDTA(0.5mol/LpH8.0) 100ml
使用时用蒸馏水稀释
50
倍。
（
8
）
样品缓冲液（
6X
）
0.25%
溴酚蓝，
0.25%
二甲苯青，
40%
（
W/V
）蔗糖
（
9
）
溴化乙锭
10mg/ml
（
10
）
琼脂糖（电泳级）
（
11
）
限制性内切酶
（
12
）
溶菌酶（
50mg/ml
，溶于
10mmol/L
Tris-HCl
，
pH 8.0
）
3.
仪器设备
:
台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、恒
温水浴箱等。
Eppendorf
离心管，
Tip
头，三角瓶等灭菌备用。
电泳仪，
电泳槽，
样品梳，
微波炉，
水浴锅，
移液器
（
20ul, 200ul
和
1000ul
）
，
离心管，
Tips(200ul,1000ul)
。
四
．
操作步骤：
1.
质粒提取
（
1
）
将
2ml
含相应抗生素的
LB
培养基加入到容量为
15ml
的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，
在
37
℃剧烈震荡（
250rpm
）培养过夜。
（
2
）
将
1.5ml
培养物转入离心管中，用台式离心机在
4
℃条件下离心
30
秒（
12,000 ×
g
）。
（
3
）
弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于
200 m l STET
缓冲液，用涡旋
混合器充分混匀。