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作为目前最好、
最专业得引物设计软件
,Oli
ｇ
o
得功能很强
,
在这里我们介绍它得一些主要功
能
:
如
:
普通引物对得搜索、
测序引物得设计、
杂交探针得设计以及评估引物对质量等等。
??
在
正式进行引物设计前
,
我们首先面临得一个任务就就是向Ｏ
ligo
程序导入模板序列
,
根据不同
得实验情况，导入模板有三种方法：
1
，
直接用键盘输入：
a,
点击
f
ｉｌ
e
菜单中得Ｎ
ew
Seq
ｕ
ence
< br>浮动命令
,
或直接点击工具栏中得
New
Seq
ｕ
ence
命令，进入序列展示窗口
;
b
，
此时即
可键入
DNA
序列；
?
ｃ
,
如果需要得话
,Oli
ｇ
o
提供碱基回放功能，在边键入时<
/p>
边读出碱基，防止输入错误。点击
Edi
ｔ菜单中得“
Read
ｂ
a
ｃｋ
on
”即可。
?
２
,
利用
复制与粘贴
:
当我们序列已经作为ＴＸ
T
文件存在或其它
o
ｌ
igo
不能直接ｏ
pen
得文件格式
,
如
wor
d
文件、
html
格式
,
这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示
窗口粘贴，ｏ
ligo
会自动去除非碱基字符
.
当序列输入或粘贴完成后
,
点击
A
ｃ
cept/
Ｄｉｓ
card
菜单中得
Ac
ｃ
ep
ｔ浮动命令，
即可进入引物设计模式。
3
?
，
如果序列已经保存为
Se
ｑ格式或者
FA
ＳＴ
A,Gen
Ｂ
an
ｋ格式时，ｏ
ligo
就可以直接打开序列文件
.
点击
Fil
ｅ菜单中得“Ｏ
pen
”浮动命令，找到所需文件，打开即可。
进入引物设计模式后
,o
ｌ
igo
一般会弹出三个窗口
,
分别就是６－碱基频率窗口
,
碱基退火温
度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，
其中得退火温度窗口就是我们引物设计得主窗口
，
其
它得两个窗口则在设计过程中起辅助作用
< br>,
比如
6
—碱基频率窗口可以使
我们很直观地瞧到
所设计引物在相应物种基因组中得出现频率，
如果我们得模板就是基因组
D
ＮＡ或混合ＤＮ
< br>A
时
,
该信息就显得有用了
,
而内部稳定性窗口则可以显示引物得
5'
端稳定性就是否稍高于
3
’
端等。
?
一，普通引物对得搜索：
?
以Ｍ
ous
ｅ
４
E(cDN
Ａ序列）为
例。我们得目得就是以
Mo
ｕ
se
4E
（
2361
ｂ
< br>p
）为模板，设计一对引物来扩增出
600
－
800
ｂ
p
长得
pcr
产物
.
1
，点击“
Se
ａ<
/p>
r
ｃ
h
“菜单中
得
ｒ
Ｐ
r
ｉ
m
ｅ
r
ｓ
and
Ｐ
ro
ｂ
e
ｓ“命令
,
进入引物搜索
对话框；
2
?
，由于我们要设计得就
是一对
PCR
引物，因此正、负链得复选框都要选上
,
同时
选上ｐ
atib<
/p>
ｌ
e pairs.
在
Olig
ｏ默认得状态下，对此引物对得要求有
:a<
/p>
，无二聚体；
b
，３’端高度特异，
GC
含
量有限定
,
d,
去除错误引发引物等。
3
，剩下得工作就是确定上、下游引物得位置及
P
Ｃ
R
产物得长度以及引物设计参数。
①单击
:
“
s
ｅａ
r
ｃ
h
Ranges
”按钮，弹出“
Se
ａ<
/p>
r
ｃ
h R
ａ<
/p>
nge
ｓ”对话框。输入上游引物
得范围
:1
—２
000,
下游引物得位置：１
00-2300
；
PCR
产物得长度
60
０—８
00bp
。
②单
击“
Paramat
ｅ
rs
”按钮进入“
Sea
ｒｃｈ
Ｐａｒａｍ
e
ｔ
< br>ers
”对话框
,
对话框种分三
个活页，分别就是：不同设定
,
参数以
及更多参数。
③在“普通设定”窗口，为我们提供了对引物非
常直观得设定方法
,
从高到低分六个等级，
最后还有一个用户定制选项。
④当我们对引物得各种参数
得含义及应该设定多大值并不就是特别清楚时，
就可以直接设定
Very
ｈ
igh/H
ｉ
gh
等来完成对引物设计参数得设定。
?
⑤当我们选中“
Automat
ｉ
c
ａ
ll
ｙ
C
ｈ
a
ｎ
ge St
ｒ
ing
”后，
Oli
ｇ
o
会在引物搜索过程中
:
如果在高等级设定中无
法找到引
物对时自动降低一个定级来进行搜索，知道找到引物对。在设计反向
PCR
引物对时
,
就选中
“Ｉ
nve
ｒｓｅ
ＰＣ
R
”复选框。
⑥我们还可以让引物得长度可以改变，以适应设定得Ｔ
m
值或
PE?
（Ｐ
rime
Effitions
，
引发效率）
。
也可以限定所选引物对得最大数目。
?
⑦在
“
Pa
ｒ
ame
ｔ
ers
窗口中，
实际上需
要我们改动得只有引物得
长度，根据试验得要求作相应得改变，如
23nt.
其她参数就
使用
Oligo
得默认值
,
一般无需改变。在“
More Par
ａ
m
ｅ
t
ｅ
rs
“窗口中，一般也无需作任何改
变，
直接用
Oligo
得默认值
.4
?
，
点击
“确认
－
“
Ok
进入搜索窗口，
再次单击
“Ｏ
K
”
后
,Oli<
/p>
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