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引物设计软件
Oligo
使用方法介绍荧光定量
PCR
仪
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荧
光定量
PCR
基因扩增仪
作为目前最好、最专业的引物设计
软件,
Oligo
的功能很强,在这里我们介绍它的一些主要功
能,如:普通引物对的
搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等
。
在正式进行引物设计前,
我们首先
面临的一个任务就是向
Oligo
程序导入模板序列,
根据不同的实验情况,
导入模板
有三种方法:<
/p>
1
、直接用键盘输入:
a
、点击
file
菜单中的
New Sequence
浮动命令,或直接点击工具栏中的
New
Sequence
命令,进入序列展示窗口;
b
、此时即可键入
DNA
序列
;
c
、
如果
需要的话,
Oligo
提供碱基回放功能,
在边键入时边读出碱基,
防止输入错误。
点击
Edit
菜单中的
“
Rea
dback
on
”即可。
2
、
利用复制和粘贴:
当我们序列已经作为
TXT
文件存在或其它
oligo
不能直接
open
的文
件格式,
如
word
文件。
html
格式,这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列
展示窗口粘贴,
oligo
会自动去除非碱基字符。当序列
p>
输入或粘贴完成后,点击
Accept/Discard
菜单中的
Accept
浮动命令,即可进入引物设
计模式。
3
、如果序列已经保存为<
/p>
Seq
格式或者
FASTA,GenBa
nk
格式时,
oligo
就可以直接打
开序列文件。
点击
File
菜单中的“
Open
”浮动命令,找到所需文件
,打开即可。
进入引物设计模式后,
oligo
一般会弹出三个窗口,
分别是
6-
碱基频率窗口,
碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳<
/p>
定性窗口,其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口,其它的两个窗口则在设计过程中
起辅助作用,比如
6-
碱基频
率窗口可
以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率,如果我们的模板是基因组
DNA
或混合
DNA
时,该信息就
显得有用了,而内部稳定性窗口则可以显示引物的
5
‘端稳定性
是否稍高于
3
’端等。
一、普通引物对的搜索:
以
Mouse 4E
(
cDNA
序列)为例。我们的目的是以
Mouse
4E
(
2361 bp
)为模板,设计
一对引物来扩增出
600-800bp
长的
PCR
产物。
1
、点击“
Search
”菜单中的“
< br>For Primers and Probes
”命令,进入引物搜索对话框;
2
、由于我们要设计的是一对
PCR
< br>引物,因此正、负链的复选框都要选上,同时选上
Compatible
pairs.
在
Oligo
默认的状态下,对此引物对的要求有:
a
、无二
聚体;
b
、
3
‘端高度特异,
GC
含量有限定,
d<
/p>
、去除错误引
发引物等。
3
、剩下的工作是确定上、下游引物的位置及
PCR
产物的长度以及引物设计参数。
①单击:“
search
Range
s
”按钮,弹出“
Search
Ra
nges
”对话框。输入上游引物的范围:
1-2000,
p>
下游引物的位置:
100-2300;PCR
产物的长度
600-800bp.
②单击“
Paramaters
”按钮进入“
< br>Search Parameters
”对话框,对话框种分三个活页,分别是:
不同设定,参数以
及更多参数。
③在
“普通设定”窗口,为我们提供了对引物非常直观的设定方法,从高到低分六个等级,最后还有一个用户定制选<
/p>
项。
④当我们对引物的各种参数的含义
及应该设定多大值并不是特别清楚时,就可以直接设定
Very high/High<
/p>
等来完成
对引物设计参数的设定。
⑤当我们选中“
Automatically Change
String
”后,
Oligo
会在引
物搜索过程中:如果在高等级设定中无法找到引
物对时自动降低一个定级来进行搜索,知
道找到引物对。在设计反向
PCR
引物对时,就选中“
Inverse PCR
”复选框。
⑥我们还可以让引物的长度可以改变,以适应设定的
Tm
值或
PE?
(
Prime E
ffitions,
引发效率)。也可以限定所选
引物对的最大
数目。
⑦在“
Parameters
”窗口中,实际上需要我们改动的只有引物的长度,根据试验的要求作相应的改变,如<
/p>
23nt.
其他
参数就使用
Oligo
的默认值,一般无需改变。在“
More
Parameters
”窗口中,一般也无需作任何改变,直接用
Oligo
的
默认值。
4
、点击“确认”
-
“<
/p>
Ok
”进入搜索窗口,再次单击“
OK<
/p>
”后,
Oligo
自动完成引物对的搜索
,并出现一个搜索结果窗
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