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引物设计软件
Oligo
使用方法介绍荧光定量
PCR
仪
|
荧
光定量
PCR
基因扩增仪
作为目前最好、最专业的引物设计
软件，
Oligo
的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功
能，如：普通引物对的
搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等
。
在正式进行引物设计前，
我们首先
面临的一个任务就是向
Oligo
程序导入模板序列，
根据不同的实验情况，
导入模板
有三种方法：<
/p>
1
、直接用键盘输入：
a
、点击
file
菜单中的
New Sequence
浮动命令，或直接点击工具栏中的
New
Sequence
命令，进入序列展示窗口；
b
、此时即可键入
DNA
序列
；
c
、
如果
需要的话，
Oligo
提供碱基回放功能，
在边键入时边读出碱基，
防止输入错误。
点击
Edit
菜单中的
“
Rea
dback
on
”即可。
2
、
利用复制和粘贴：
当我们序列已经作为
TXT
文件存在或其它
oligo
不能直接
open
的文
件格式，
如
word
文件。
html
格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列
展示窗口粘贴，
oligo
会自动去除非碱基字符。当序列
输入或粘贴完成后，点击
Accept/Discard
菜单中的
Accept
浮动命令，即可进入引物设
计模式。
3
、如果序列已经保存为<
/p>
Seq
格式或者
FASTA,GenBa
nk
格式时，
oligo
就可以直接打
开序列文件。
点击
File
菜单中的“
Open
”浮动命令，找到所需文件
，打开即可。
进入引物设计模式后，
oligo
一般会弹出三个窗口，
分别是
6-
碱基频率窗口，
碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳<
/p>
定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中
起辅助作用，比如
6-
碱基频
率窗口可
以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组
DNA
或混合
DNA
时，该信息就
显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的
5
‘端稳定性
是否稍高于
3
’端等。
一、普通引物对的搜索：
以
Mouse 4E
（
cDNA
序列）为例。我们的目的是以
Mouse
4E
（
2361 bp
）为模板，设计
一对引物来扩增出
600-800bp
长的
PCR
产物。
1
、点击“
Search
”菜单中的“
< br>For Primers and Probes
”命令，进入引物搜索对话框；
2
、由于我们要设计的是一对
PCR
< br>引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上
Compatible
pairs.
在
Oligo
默认的状态下，对此引物对的要求有：
a
、无二
聚体；
b
、
3
‘端高度特异，
GC
含量有限定，
d<
/p>
、去除错误引
发引物等。
3
、剩下的工作是确定上、下游引物的位置及
PCR
产物的长度以及引物设计参数。
①单击：“
search
Range
s
”按钮，弹出“
Search
Ra
nges
”对话框。输入上游引物的范围：
1-2000,
下游引物的位置：
100-2300;PCR
产物的长度
600-800bp.
②单击“
Paramaters
”按钮进入“
< br>Search Parameters
”对话框，对话框种分三个活页，分别是：
不同设定，参数以
及更多参数。
③在
“普通设定”窗口，为我们提供了对引物非常直观的设定方法，从高到低分六个等级，最后还有一个用户定制选<
/p>
项。
④当我们对引物的各种参数的含义
及应该设定多大值并不是特别清楚时，就可以直接设定
Very high/High<
/p>
等来完成
对引物设计参数的设定。
⑤当我们选中“
Automatically Change
String
”后，
Oligo
会在引
物搜索过程中：如果在高等级设定中无法找到引
物对时自动降低一个定级来进行搜索，知
道找到引物对。在设计反向
PCR
引物对时，就选中“
Inverse PCR
”复选框。
⑥我们还可以让引物的长度可以改变，以适应设定的
Tm
值或
PE?
（
Prime E
ffitions,
引发效率）。也可以限定所选
引物对的最大
数目。
⑦在“
Parameters
”窗口中，实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据试验的要求作相应的改变，如<
/p>
23nt.
其他
参数就使用
Oligo
的默认值，一般无需改变。在“
More
Parameters
”窗口中，一般也无需作任何改变，直接用
Oligo
的
默认值。
4
、点击“确认”
-
“<
/p>
Ok
”进入搜索窗口，再次单击“
OK<
/p>
”后，
Oligo
自动完成引物对的搜索
，并出现一个搜索结果窗
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