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引物延伸分析
（
primer
extension
analysis
）
主要用于
mRNA
5
′
端作图。
poly
（
A
）
+RNA
首先与过量
5
′
端标记的且
与靶
RNA
互补的单链寡核苷酸引物杂交，
然后用反转录酶延伸这个
引物。产生的
cDNA
与
RNA
模板互补且长度与引物
< br>5
′
端和
RNA 5
′
端之间的距离相等。该法在
mRNA
5
′
端作图方面具有下述优势：一旦引物被子起
始合成，延伸反应大多会进行到
RNA
模板的
< br>5
′
最末端，产物大小可精确测定。此外，产物长度不会
受靶基因内含子分布与大小的
影响。
几乎所有的引物延伸实验多采用长
20~30
bp
合成寡核苷酸引物。当用于和靶序列杂交
的寡核苷
酸引物
位于距
mRNA
5
′
端
150
bp
以内时，可获得最佳结果
。在更远
距离处杂交的
引物能增加异源延伸产物，因为反转录酶会在模板
RNA
的二级结构复杂区终止。因此，
在
设计引物时，除实际的序列之外还应考虑到杂交的位置。应尽可能使寡核苷酸的
GC<
/p>
含量在
50%
左右且在
< br>3
′
端为
G
或
C
。
用两个引物在
mRNA
相距一段已知距离（
20~50 bp
）的区域上
分别杂交则更为理想。
大小差别
等于两个引物间距的延伸产物，
可对结果进行验证。
为了找
到一对能产生明确延伸产物的引物，合成多个引物也许是必须的。
在很多情况下，引物延伸反应会产生两个产物：
全长
cDNA
分子和短
2~2 bp
< br>的反转录产
物。
这可能代表着多个转录起始位点导致的<
/p>
mRNA 5
′
端不均一性。
有时，
在临近靶
mRNA
加
帽位点的甲基化残基处的提前终止将产生更短的产物。
与帽
子结构相关的条带在不同
mRNA
样品中的化学定量是不同的
，
对于一份给定样品总是一个定值。
为了区分反转录假象和真正
的
mRNA 5
′
端不均一性，用
5
′
端标记的探针
进行
S1
核酸酶分析是一个很好的方法。
与未进一步分离的哺乳动物
RN
A
相比，
poly
（
< br>A
）
+RNA
样品可得到干净得
多的结果，
因为前者分产生多到不可接受的提前终止产物。通过在更高浓度（
5
mmol/l
）
dN
TP
下进行
延伸反应，并在用互补区位于
mRNA 5
′
端
50~100
bp
以内的引物可将假象降至最低。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸引物一度是必须的。
这些年来，
除非总是产生延伸
产物的梯状条带，许多研究者已不再费心纯化了。
在杂交反应中，核苷酸引物分子的量应大约
10
倍于靶
mRNA
。更多量的引物可能会导<
/p>
致非特异延伸和人为条带的出现。
所以，
且一定量
RNA
与不同量的引物
（通常
为
20~40
fmol
，
104~105
cpm
）进行一系列预实验是可取的。
复性温度极大地影响引物延伸实验的质量，
< br>值得在预实验中调查以确定最佳复性温度。
多数情况下，对于
GC
含量为
50%
，
20~30 bp
的引物，其最佳复性温度在
40~
60
℃
之间。可
以设置一系列以
5
℃
为间隔的引物延伸反应来确定最佳复性温
度。
当用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
延伸产物时，大小已知、末端标记的
DNA
片段可用作相
对分子质量标记参照物。但最好是采用与延伸反应相同引物的基于
DN
A
模板的测序图，通
过对照测序图读出引物延伸反应产物的大小
，靶
RNA
的
5
′
端可定位于一个特定的碱基。
在研究启动子区时往往采用引物延伸分析（
primer
extension analysis
，看了些相关资
料，感
觉收获不小，和大家分享一下。
1
、引物延伸分析（
primer
extension analysis
）
< br>引物延伸分析用于定量
mRNA
的量，
< br>测定低丰度的
mRNA
的种类。
另外引物延伸实验可
标定转录产物的
5`-
端，确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到
RNA
链的互补
区域，随后用
RNA
作为
模板，用反转录酶延伸引物得到
cDNA
，用变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳
分析
cDNA
。
cDNA
的长度为引物的标记的核苷酸到
RNA-5`
末端间的碱基数，所得
cDNA
的
量和目的
RNA
的起始量成正比。理想的引
物是
ssDNA,
长度为
20-40
个核苷酸，与要分析的
转录产物的
5`
末端区域互补。延伸产物小于
150
个
核苷酸，可得到最佳分离效果。引物延伸
实验非常灵敏，可检测
2
pg
的转录产物，这相当于
1
个细胞中的
1
个
R
NA
。引物延伸实验非
常适合于对单个基因作定量和定性分析。
（
1
）
引物延伸分析所用试剂：
引物延伸实验需要模板
RNA
，
可用总
RNA
或
poly(A)+RNA
。
一个特异的末端标记的核苷酸或
DNA
片段作为引物，
用反转录酶合成
cDNA
。
除
RNA
模板和
标记的引物，
还需要反转录酶，
AMV
或
MMLV<
/p>
反转录酶、反应溶液、脱氧核苷酸、聚丙烯
酰胺凝胶试剂，和电泳
装置。所得结果用放射自显影和磷成像仪分析。
（
2
）引物延伸系统的组分：引物延伸系统中
AMV
反转录酶和反应溶液、焦磷酸钠、正
对照
RNA
模版和对照引物、去磷酸的
PhiX174Hinf
I DNA
标准分子参照物、
T4
多
核苷酸激
酶和溶液、
样品溶液、
AMV
反转录酶
2X
溶液
100 mMTris-HCl
（
pH8.3,
42
℃）
、
100
mMKCl
、
20 mM
MgCl2
、
20 mM
DTT
、
2 mM
每一种
dNTP
、
1 mM
精胺。
PhiX174
标准分子参照物和
T4
多核苷酸激酶用作引物标记，
和确定延伸产物长度的标准。
对照
RNA
可得到
87
个碱基的
延伸产物作为正对照。引物延伸反应中用焦磷酸钠
和精胺可增加全长
cDNA
的得率，抑制模
板
RNA
产生发卡结构。虽然其作用方式未确定，但结果是
增加全长
cDNA
的得率，抑制模板
R
NA
产生发卡结构。
MMLV
被焦磷酸
钠和精胺抑制，如使用
MMLV
，放线菌素
D
可用于增加
全长
cDNA
的得率，抑制模板
RNA
产生发卡结构。焦磷
酸钠和放线菌素
D
抑制
cDNA
第二条
链的合成。
（
3
）引物延伸实验的优化：
①杂交温度。
引物延伸实验中所用的杂交温度是最关键的需优化的因素
。
一般而言，
最
高紧密度，或引物和互
补序列完全杂交所需的最适条件是，低于引物溶解温度的
5oC
。低于
最高紧密度的温度可极大地增加杂交速度。
应在不同的紧
密度的杂交温度下作杂交，
以控制
引物和特异
< br>RNA
的杂交。增加杂交紧密度时，带来的延伸产物的丢失表明，引物和相关的<
/p>
却不是等同的转录产物杂交。在碱和双价阴离子的存在下，
RNA
在较高温度会降解，应用
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