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基于
CRISPR
的核酸检测技术——
SHERLOCK
CRISPR/Cas
技术
以出众的基因编辑能力闻名于世，
但显然这技术应用范围绝不仅限于基
< br>因编辑。
CRISPR/Cas
技术的大牛
Jennifer Doudna
教授早在
2016
年就将该技术应用于
RNA
检
测，
只是由于灵敏度太低而缺乏应用价值。
随后
张锋利用
Cas13
蛋白的天然
RNa
se
活性将其
改进，使之有了实际应用价值，并将其取名为
SHERLOCK
（
Specific
High-sensitivity Enzymatic
Reporter unL
OCKing
）
，并且开发了升级版的
SHERLOCK v2
。后来
Jennifer Doudn
a
的实验室利
用
Cas12a
的非特异性
ssDNA
降解能力开发出另一种称
为
DETECTR
的方法。
SHERLOCK
的原理
SHERLOCK
的核心是一种叫做
Cas13<
/p>
的
CRISPR
相关蛋白。
Cas13
包含四个不同的家族
成员（
Cas13a-d
）
，是一种
RNA
引导的
RNase
，靶向
RNA
的单链区域，在具有特定碱基的靶
R
NA
区域产生多个切割位点。
Cas13
表现出靶依赖性的混杂
RNA
酶活性，导致旁观
RNA
分
子的反式切割，这种效应被称为“
collateral activity
（附带活性）
”
。研究人员利用这一“脱
靶缺陷”
，加入一种可淬灭的荧光
RNA
，当荧光
RNA
被切开时，会发出荧光信号而显示检测
结果。
最近发现其它类型
CRISPR-C
as
系统的
Cas
酶也显示
collateral activity
，
如
Cas12
的亚
家族。
尽管
Cas13
具有称为原
间隔物侧翼位点（
PFS
）的
PAM<
/p>
样序列基序，仅对某些目标
位点有活性，但是许多非常活跃的
Cas13
直系同源物，例如
LwaCas
13a
，不显示
PFS
。
DETECTR
技术的
原理与
SHERLOCK
相似。
Cas
12a
（
Cpf1
）
< br>通过
crRNA
靶向特定的双链
DNA
，
切割目标双链
DNA
后，会对所有的单链
DNA
发动任意切割。将<
/p>
ssDNA-
荧光淬灭（
FQ
）报道
基团加入反应中，在
ssDNA
降解时就会产生荧信号。
SHERLOCK
的流程
利用
SHERLOCK
系统检测样品的流程为：<
/p>
?
收集样品
，提取样品的
DNA
或者
RNA
；
?
以提取的
DNA
为模板在
42
℃下进行等温扩增反应，
或者将
R
NA
逆转录成
cDNA
，
以
cDNA
为模板在
42<
/p>
℃下进行等温扩增反应；
?
以等温扩增产物为模板体外转录单
链
RNA
；
?
转录产物与
Cas13
和检测探针孵育，检测荧光信号。
制备
SHERLOCK
系统需要原核表达和纯化
Cas13
，设计
crRNA
并且体外转录，制备带荧
光标记的单
链
RNA
探针。