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激光共聚焦显微镜的原理与应用范围
激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共
< br>轭聚焦原理和
装置，并利用计算机对所观察的对象进行
数字图象处理的一套观
察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了
30%~40%
，使用紫外或可见光
激发荧光探针，从
而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观
察生理信号及细胞形态的
变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗
传学等领域中新一代的研究工具
。
1
激光扫描共聚焦显微镜（
LSCM
）的原理
从基本原理上讲
,
共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜
,
< br>它对普通光镜从技
术上作了以下几点改进
:
1
．
1
用激光做光源因为
激光的单色性非常好
,
光源波束的波长相同
,
从根本上
消除了色差。
1
．
2
采用
共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板
,
将焦
平面以外的杂散光挡住
,
消除了球差
;
并进一步消除了色差
1
．
3
采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点
,
用十分细小的
激光束
(
点光源
逐点逐行扫描成像
,
再通过微机组合成一个整体平面的或立体的
像。而传统的光镜是
在场光源下一次成像的
,
标本上每一点的图像都会受到相邻点
的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1
．
4
用计算机采集和处理光信号
,
并利用光电倍增管放大信号图
在共聚焦显微镜中
,
计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像
,
得到的图像是
数字化的
,
可以在电脑中进行处理
,
再一次提高
图像的清晰度。而且利用了光电倍增
管
,
可以将很微弱的信号放大
,
灵敏度大
大提高。由于综合利用了以上技术。可以说
ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算
机技术的完美结合
,
是现代技术发展
的必然产物。
2
ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用
目前
,
一台配置完备的ＬＳＣＭ在功
能上已经完全能够取代以往的任何一种光
学显微镜
,
它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合
,
如倒置光学显微
镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差
显微镜
(
ＰＨ
、微分干涉差
显微镜
(
ＤＩＣ
等
,
因此被称为万能显微镜
,
通过它所得
到的精细图像可使其他的显
微镜图像无比逊色。
2
．
1
观察活细胞、活组织
ＬＳＣＭ在不损伤细胞的前提下
,
对活组织、活细胞
进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程
(
如脱水、脱蜡、染色等
;
而且观察过的样品还可以
继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研
究尤为重要。这可以说是ＬＳＣ
Ｍ最大的优势。
2
．
2
生化成分精确定位观察配合专用的分子探针
,
对于要检测的成分不仅可以
定位到细胞水平
,
还可以定位到亚细胞水平和分子水平
2
．
3
动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描
,
就可分析细胞结构、内
含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的
是使用ＬＳＣＭ观察心肌或平
滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或ｐＨ的动态变化。<
/p>
2
．
4
数据、图像的数字化用计算机代替了普通的照相机
,
得到的图像是数字化
的
,
可及时输出或长期储存
,
而且还可进一步加工处理。
2
．
5
定量测量首先应用专一的荧光探针对样品进行染色
,
样品的荧光强度和所
测成分的含量呈正比
,
如果其余条件固定
,
通过对比各组样品之间的荧光强度值
,
可
得出特定成分的含量比。
3
华中地区有激光共聚焦显微镜机构的品牌和技术参数
3
．
1
中国科学院武汉
病毒研究所，
3
．
< br>2
湖南中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所
LSCM(BIO-
ROD1024,HOMEL HEMPSTEAD,UK
发表过应用激光扫描共聚焦显微镜观察骨组织为损伤的实验研究
3
．
3
华中科
技大学同济医学院附属同济医院神经内科
激光扫描共聚焦显微
镜
(
ＭＲＣ
1024
型
,
美国ＢｉｏＲａｄ公司生产
发表过激
光扫描共聚焦显微镜检测核因子
κ
Ｂ
4
激光扫描共聚焦显微镜的使用（
cAMP
在体测量为例）
4
< br>．
1
样品制备
4
．
1
．
1
切片
实验标本要求单层，并能
很好地贴附在样品池中。所以，组织标
本无论
是石蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。常用的贴附剂有：多聚赖氨
酸，伴刀豆球蛋白，蛋清，琼脂明胶
cell-Tak,
vectabond
等。
4
．
1
．
2
培养细胞
培养细胞可以满足要求，如果用购置仪器
时所带的薄底培养
瓶进行培养
则更佳
4
．
1
．
3
激光共
聚焦观察样品处理注意事项
首先要尽量保持生物材料的天然状
态，避免赝像、变形和失真，因此须将生物
材料做固定处理；制片必须薄而透明，才能在
显微镜下成像，除将材料切成薄片或
通过轻压或其他手段使之分散外，还需采用其他方法
使它透明和染色，以便更好地
观察到结构的细节。需长期
保存的制片，还应进行脱水和封固。
显微制片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法<
/p>
4
类。
4
．
2
荧光探针的选择
荧光探针的发展非常迅速，目前仅美国
Molecular
Probes
公司就可提供
1800
多
种荧光探针
[3
，每年该公司还不断推
出新的荧光探针。通常每项检测内容或被测物
质都有几种或几十种有关的或特异的荧光探
针。选择合适的荧光探针是有效地进行
实验并获取理想实验结果的保障。荧光探针的选择
主要从以下几个方面考虑：
(1
现有仪器所采用的激光器。如我
校购进的激光扫描共聚焦显微镜
(ACAS
ULTMA312
，美国
Meridian
公司产品
采用氩离子激光器，激发波
长为
351
～
364nm
，
488nm
，
514nm
，可激发多种荧光探针
；
(2
荧光探针的光稳定性和光漂
白性
。在进行荧光定量和动态荧光监测时，要求荧光探针有较好的光稳定性越高越
好，也可通
过减少激光扫描次数或降低激光强度的方法，来减轻光漂白的程度。但
在进行膜流动性或
细胞间通讯检测时则需要荧光探针既有一定的光稳定性又要有一
定的光漂白性；
(3
荧光的定性或定量。仅做荧光定性或仅是
观察荧光动态变化时，选择单波
长激发探针，无需制作工作曲线。做定量测量时最好选用
双波长激发比率探针，利
于制定工作曲线；
(4
荧光探针的特异性和毒性。尽量选用毒性小、特异性高的探
针；
(5
荧光探针适用的
pH
。大多数情况下细胞的
pH
在生理条件下，但当
pH
不
在此范围时，考虑适用该环境
pH
的荧光探针是有必要的。同时应注意染液自身的
pH
值会影响带电荷的荧光探针与胞内组份之间的结合，因此在染液的配备时需加
以考虑。
不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，除
综合考虑以上因素以外，有条
件者应进行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。此外，许
多荧光探针是疏水性
的，很难或不能进入细胞，需使用其乙酰羟甲基酯
< br>(acetoxymethyl,AM
形式，也就
是荧光
探针与
AM
结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过质
膜进入细
胞，在细胞内荧光探针上的
AM
被非特异性酯酶水解，去掉
AM
后的
荧光探针不
仅可与细胞内的靶结构或靶分子结合且不易透出质膜，从而能有效的发挥作用
。