细胞自噬检测

细胞自噬的研究方法

正常培养的细胞自噬活性 很低，

不适于观察，

因此，

必须对自噬 进行人工干预和调节，经报

道的工具药有：

一、自噬诱导剂

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin

：模拟内质网应激

(2) Carbamazepine/ L-690

，

330/ Lithium Chloride

（氯化锂）

：

IMPase

抑制剂

（即

Inositol

monophosphatase

，肌醇单磷酸酶）

< br>

(3) Earle's

平衡盐溶液：制造饥饿

(4) N-Acetyl-D-sphingosine

（< /p>

C2-ceramide

）：

Class I PI3K Pathway

抑制剂

(5) Rapamycin

：

mTO R

抑制剂

(6) Xestospongin B/C

：

IP3R

阻滞剂

二、自噬抑制剂

(1) 3-Methyladenine

（

< br>3-MA

）：（

Class III PI3K

）

hVps34

抑制剂

(2) Bafilomycin A1

：质子泵抑制剂

(3) Hydroxychloroquine

（羟氯喹）：

Lysosomal lumen alkalizer

（溶酶体腔碱化剂）

除了选用上述工具药外，

一般还需 结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：

包括反义

RNA

干扰技术（

Knockdown

）、突变株 筛选、外源基因导入等。

三、自噬过程进行观察和检测

< /p>

细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：

1

、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。

的特征为：

新月状或杯状，

双层或多层膜，

有包绕胞浆成分的趋势。

自噬体

（

AV1

）

< br>的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自

噬溶酶体（

AV2

）的特征为：单层膜，胞浆成分已降 解。（

autophagic vacuole

，

AV

）

2

、在荧光显微镜下采用

GFP- LC3

融合蛋白来示踪自噬形成

由于 电镜耗时长，不利于监测（

Monitoring

）

LC3

在自噬形成过程中发< /p>

生聚集的现象开发出了此技术。

无自噬时，

GFP-LC3

融合蛋白弥散在胞浆中；

自噬形成时，

GFP-LC3

融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明 亮的绿色荧光斑点，一个

斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。