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荧光染料基础知识大全
益阳纺织染整团队
今天
荧光显微镜技术的基本原理是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体的可视化效果，比如在目的
蛋白后面连
一个
通用的荧光蛋白—
GFP
。在组织样本中，目的基因无法进行克隆，则需要用免疫荧光染色等其他技术手
段来观
察目的蛋白。为此，就需要利用抗体，这些抗体连接各种不同的荧光染料，直接或间接地与相应的
< p>
靶结构相结
合。此外
，借助荧光染料，荧光显微镜技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖等其他
结构进行染色，
即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。
1
免疫荧光
(IF)
在荧光显微镜技术中，
可以通过两种方式观察到你的目的蛋白：
利用内源荧光信号，
即通过克隆手段，
用遗传学方法将荧光蛋<
/p>
白
与目的蛋白相连；或利用荧光标记的抗体特异性结合目的蛋白。
有些生
物学问题采用第二种方法会更有用或更有必要。
比如，
组织学样
品无法使用荧光蛋白，
因为通常来说，
标本都是从无法
保
存荧光蛋白的生物体中获取。此外，当有一个有功能的抗体可用时，免疫荧光法会比荧光蛋白技术快很
多，因为后者必须先
克
隆目的基因再将
DNA
转染到适当的细胞中。
荧光蛋白的另一项劣势在于其本身
属于蛋白质。
因此，
细胞内的这些荧光蛋白具有特定的蛋白质特
性，
其会导致附着的目的蛋
白
质发生功能紊乱或出现误释的情况
。然而，荧光蛋白技术仍然是观察活细胞的首选方法。
免疫荧光法利用了抗体可以和相应
抗原特异性结合的这个特性，
对此它还有两种不同的表现形式。
最简单的方式是使用可与目
的
蛋白相结合的荧光标记抗体。这种方法被称为
“直接免疫荧光法
”。
在很多情况下，我们可以利用两种不同特性的抗体。第一种抗
体可以结合目的蛋白，但其本身并未进行荧光标记
(
一抗
)
。第
二
种抗体本身就携带荧光染料
(
二抗
)
，并且可以
特异性结合一抗。这种方法被称为
“间接免疫荧光法
”。
这种方法存在诸多优势。一方面，
它会产生放大效应，因为不只一个二抗可以与一抗相结合。另一方面，没有必要始终用荧光
染料标记目的蛋白的每个
抗体，
但可以使用市售荧光标记的二抗。
免疫荧光中广泛使用的荧光染料包括
FITC
、
TRITC
或一些
Alexa
Fluor?
染料，下文均有提及。
2
FITC
和
TRITC
异硫氰酸荧光素
(FITC)
是一种有机荧光染料，目前，这种荧光染料仍用于免疫荧光和流式细胞术中。在
495/517 nm
处，该染
料会产生激发
/
< br>发射峰值，并可借助异硫氰酸盐反应基团与不同抗体结合，该基团可以和蛋白质上的氨基
< br>
、巯基、咪唑、酪氨酰、
羰基等基团相结合。
而它的基本成分
——
荧光素，其摩尔质量为
332
g/mol
，常被用作荧光示踪剂。
FITC(389 g/mol)
是用于荧光显微镜技术的首批
染料，且其被当成
Alexa
Fluor?488
等后续荧光染料的发端。该染料的荧光活性取决于它的大共轭芳香
电子系统，而该系统受蓝
色光谱中的光所激发。
经常与
FITC
同时使用的另一种染料是与其相似的
TRITC [
四甲基罗丹明
-5(6)-
异硫氰酸
]
。与
FITC
相反，
TRITC
并非荧光素，而
是罗丹明家族的衍生物。罗丹明也具有一个大的共轭芳香电子系统，正是该系统引发了它们的荧
光行为。
还有一点与
FITC
相反，
TRITC (479 g/mol)
由最大波长为
550nm
的绿色光谱中的光所激发，它的最大发射波长为
白质
(
例如，抗体
)
结合也基于异硫氰酸盐反应基团。
573
nm
。与蛋
虽然
FITC
和
TRITC
仍在使用，但由于它们属于发光相对较弱的荧光染料且它们的优势仅仅是经济实惠，因此，在最新的显微
镜技术中并不推荐。
3
青色素
图
1
：果蝇胚胎发育，绿色：
FITC
；红
色：
TRITC
这类荧光染料相对较少，从青色素衍生而来，也是其名称的由
来：
Cy2
、
Cy3
、
Cy5
和
Cy7
。
上述所有青色素均可以通过其反应基
团与核酸或蛋白相连。例
如，采用了蛋白标记的马来酰亚胺基团。有趣的是，对于荧光，
Cy5
对其周边电子环境非常敏感，该
特征可用于酶测定。
附着蛋白质的构
象改变会导致荧光发射产生阳性或阴性变化。此外，
Cy3
和
Cy5
还可用于
FRET
试验。青色素染料是一种相对
较老的
荧光染料，但却
是其他荧光染料在亮度、耐光性、量子产率等方面得以改善的基础。
4
Alexa Fluor?
染料
Alexa Fluor? <
/p>
染料是带负电荷且亲水的荧光染料系列，该系列染料囊括范围较广，且经常用于荧光显微镜
技术之中。
这些染料的名称是由其发明者
Richard Paul Haugland
以他儿子
Alex
Haugland
的名字命名的。该产品标识是
Molecular Probes
（美国生命科学技术公
司
Life Technologies
旗下子公司，注：
2014
年
2
月
Life
Technologies
被
Thermo Fisher
收购）的商标。此
外，这些产品标识
中也涵盖了相应的激
光激发波长。
例如，应用范围很广且最大激发波长为
493 nm
的
Alexa Fluor?488
，可由标准的
488 nm
激光激发。
Alexa
Fluor?488
的最大发射
波长为
519 nm
，
正是因为具备上述特性，使得
Alexa Fluor?488
与
FITC
的属性相似。
尽管
Alexa
Fluor?488
是一种荧光素衍生物，
但与
FITC
相反，它拥有更佳的稳定性和荧光亮度，
且
pH
敏感度也更低。
所有
Alexa Fluor?
染料（比
如，
Alexa Fluor?546
、
Alexa Fluor?633
）都是不同基础荧光物质的
磺化形式，例如，荧光素、香豆素、青
罗丹明，它们的摩尔质量在
410
至
1400 g/mol
范围之内。
色素或
图
2
：小鼠转基因胚胎、肢间体节，
小鼠转基因胚胎的
5
个肢间体节：
EpaxialMyf5 eGFP
；
GFP-Alexa 488
免疫组化染色；用
Desmin-
Cy3
对胚胎肌肉纤维进行染色，用
Hoechst Size
自上而下揭示细胞核：
mm
(a)
，
800
μ
m( b)
。图片来源：
Aur
é
lie Jory,
CellulesSouches et D
é
veloppement,
Institut Pasteur, Paris,France and Imaging centre
of IGBMC, IGBMC
图
3
：小鼠成纤维细胞，绿色：
普朗克研究所
·
G
ü
nter Giese
博士
F-Actin
，
FITC
；红色：
Tubulin
，
Cy5
；蓝色：细胞核，
DAPI
。图片来源：德国
·海德尔堡
·马克斯
-
5
DNA
染色
在荧光显微镜技术中，不只研究
蛋白结构，核酸同样具有重要的研究意义。有时候，必须通过检测细胞核来确定细胞的精确位
置及其数
量。最常用的一种
DNA
染色剂当属
DAPI
（
4',6-
二脒基
-2-
苯基吲哚
）
，其可与
DNA
双螺旋的
A-T
富集区域相结合。如
果
DAPI
附着到
DNA
上，
其荧光强度将比游离状态要高。该染色剂受最大波长为
358 nm
的紫外光激发，其发射光谱非常宽，
在
461 nm
处达到峰值。此外，还可对弱荧光进行
RNA
结合检测。在这种情况下，发射波长将转移至
能够穿透整个细胞膜。因此，它可以用于固定和活细胞之中。
500 nm
。有趣的是，
DAPI
第二种被广泛使用的
DNA
染色剂就是
Hoechst
染料系列，这些染料原先都是由
Hoechst AG
这家化学公司生产的。
Hoechst 33258
、
Hoechst 33342
以及
Hoechst 34580
均为双苯酰亚胺，可嵌入
A-T
富集区域，因此，该系列染料很少用到。与
DAPI
相
似，这三种染色剂都可受最大发射波长为
455
nm
的紫外光激发，而未被结合的染色剂，其最大发射波长在
510
–
540 nm
之间。
Hoechst
染色剂还具有细胞渗透性，
因此可用于活细胞或已固定的细胞中。
该染色剂与
DAPI
的不同之处在于，
它们的毒性较低。
碘化丙啶
（
Propidium-Iodide
，
PI
）是一种不能透过细胞膜的
DNA
染色剂。
由于具备上述特性，
该染色剂无法进入完整的细胞中，
因
此，该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。此外，碘化丙啶还是一种嵌入剂，但对于不同的碱基并不存
在结合的
差异性。该染色剂与核酸结
合后，最大激发波长为
538 nm
，最大发射波长为
617 nm
。未结合
PI
的最大激发和发射波长和光强
会更低一些。
PI
还可结合
RNA
，同时无需改变自
身的荧光特性。有时候为了区分
DNA
和
RNA
，有必要使用适当的核酸酶。
不需要前期处理，
吖啶橙就可以鉴别
DNA
与
RNA
。吖啶橙与
DNA
结合后，
最大激发
/
发射波长为
502 nm/525 nm
，而与
RNA
结合后，最大激发
/
发射波长为
460 nm/650 nm
。此外，它还能够进入溶酶体等
酸性区室。在这里，阳离子染料被质子化。在这
种酸性环境下
，吖啶橙由蓝色光谱中的光激
发，但发射波长在橙色区域达到最大。由于凋亡细胞具有大
量被吞噬的酸性区室，
因此，吖啶橙常用作此类细胞的标记物。
6
区室和细胞器特异性染料
在荧光显微
镜技术中，往往要对溶酶体、核内体等细胞区室以及线粒体等细胞器进行染色。为此，该部分介绍
了一系列可供选
择使用的特异性染料。
观察线粒体最常用的方法就是利用
MitoTracker?
，它是一种可透过细胞的染料，包
含轻度巯基化的氯甲基活性部分。正因如此，
它可与半胱氨酸
残基的
游离硫醇基反应，从而与基质蛋白实现共价结合。
MitoTracker?
有不同的颜色和修饰类型（参见表
1
），
此外，它还是
Molecular
Probes
的商标。与罗丹明
123
（
Rh123
）
或
tetramethylrosamine
等常规线粒体特异性染色剂不同，在
用固定剂破坏膜电位
后，
MitoTracker?
不会被洗掉。
依据线粒体染色剂，还
有些染料可以标记溶酶体等酸性区室，这类染料被称为
LysoTracker
。它们由连接一个荧光基团的弱碱基
团组成，具有膜穿透性。最有可能的情况是，这些碱基因质子化作用的影响而对酸性区室具有亲和性。
LysoTracker
具有多种不
同的颜色可供选择（参见
表
1
）。
与溶
酶体相似的区室是酿酒酵母等真菌中的液泡，这种膜密闭空间也是一种酸性环境。如果要在荧光显微镜下观察上述
区室，
则要使用
FM 4-64?
或
FM
5-95?
等苯乙烯基染料。
对于蛋白质分泌实验，
内质网
（
ER
）
具有重要的研究意义。
对上述区室进行染色的一种典型染料为
DiOC6
（
3
）
< br>
。该染料虽然偏好
ER
，
但仍会结合线粒体等其他细胞器膜。对
ER
进行特异性染色的另一种方法是，使用
ER-Tracker Green
和
Red
等
ER-
Tracker
，而
ER-
Tracker Green
和
Red
是基于
BODIPY
的两种染料，其与格列本脲（一种磺酰基脲酶）
连接，并可与仅存于内质网膜上的
ATP
敏感性钾通道结合。
BODIPY
（硼
< br>-
二吡咯
亚甲基，
boron-dipyrromethene
）是一种几乎不溶于水的、对
pH
相对不敏感的染料
基团，该染料对蛋
白质标记没太大用处，但却是脂质和膜标记的良
好工具。
对于与
ER
相邻的高尔基体，可以用
NBD C6-ceramide
和
BODIPYFL C5-ceramide
等荧光神经酰胺类似物对其进行标记。
上述神
经酰胺为鞘脂类，其
在高尔基体中高度富集。
借助基于脂质的染料，可以对脂筏等特异膜区域进行染色。使用
NBD-6Cholestrol
或
NBP-12 Cholesterol
可以观察胆固醇富集区
域
(
Avanti Polar
Lipids
)
。
除了使
用特异性非蛋白荧光染料对细胞区室进行标记之外，还可以借助对细胞中不同位置有偏好的蛋白质对目标区域进行
染色。
这些蛋白质可以和荧光染
料相
连，并可通过荧光显微镜进行观察。运用这种方法的一个实例是：麦胚凝集素
(WGA)
可以与细胞
质膜中的唾液酸和
N-
乙酰葡萄糖胺基特异性结
合，将
WGA
与荧光染料偶联，这样我们就可以观察到细胞质膜了。
图
4
：
Pukinje
细胞，
小鼠小脑皮质三重标记的纵侧截面图
33258
红色：
anti
—
calbindinD28k/Cy3
；绿色：
anti-
GFAP/Cy5
；蓝色：
Hoechst
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