-
pET
原核表达
pET
载体中，目标基因克隆到
T7
噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞<
/p>
提供
T7 RNA
聚合酶来诱导表达。
Novagen
的
pET
系统不断扩大，提供了用于表达的新
技术和选择，
目前共包括<
/p>
36
种载体类型、
15
种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目
标蛋白的许多其它相关产品。
优点
·
是原核蛋白表达引用最多的系统
·
在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低
·
真正的调节表达水平的“变阻器”控制
·
提供各种不同融合标签和表达系统配置
·
可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋
白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌
·
许多载体以
LIC
载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆
PCR
产物
·
许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化
阳性
pFORCE
TM
克隆系统具有高效克隆
PCR
产物、阳性选择重组体和高水平表达目标
蛋白等特点。
pET
系统概述
pET
系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统
。根据最初由
Studier
等开发
的
T7
启动子驱动系统，
Novagen
的
pET
系统已用于表达成千上万种不同蛋白。
控制基础表达水平
pET
系统提供
6
种载体
-
宿主菌组合，
能够调节基础表达水
平以优化目标基因的表达。
没
有单一策略或条件适用于所有目标
蛋白，所以进行优化选择是必要的。
宿主菌株
质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有
T7
RNA
聚合酶基因的宿主菌
（
λ
DE3
溶原菌）中表达目标蛋白。在
λ
DE3
溶原菌中，
T7
RNA
聚合酶基因由
lacUV5
启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此
适合于表达其产物对宿主细胞生长
无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有
pLysS
和
pLyE
时调控会更严紧。
pLys
质粒编码
T7
溶菌酶，
它是
T7 RNA
聚合酶的天然抑制物，
因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基
因的能力。
pLysS
宿主菌产生低量
T7
溶菌酶，而
pLysE
宿主菌产生更多酶，因此是最
严紧控制的
λ
DE3
溶原菌。
有
11
种不同
DE3
溶原化宿主菌。
使用最广泛的为
BL21
及其衍生菌株，
它的优点在
于缺
失
lon
和
ompT
蛋白酶。
B834
菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，
因此可用
35 S-
甲硫氨酸和
硒代甲硫氨酸
对目标蛋白进行高特异活性标记。
BLR
为
recA
-
衍生菌株，改善了质粒单
体产量，
有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶
(
trxB
)
突变菌株
(AD494,BL21
trxB )
，
有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。
Origami TM
和
OrigamiB
菌株
为
trxB/gor
双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。
Origami
和
OrigamiB
宿主菌的
主要优点
是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。
新的
Rosetta TM
菌株补充了四种大肠杆
菌稀有密码子的
tRNA
，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核
蛋白低表达。
其它菌株背景包括
K-12
菌株
HMS174
和
NovaBlue
，象
BLR
一样为
recA
-
。这些菌
株可稳定表达其产物可能导致
DE3
噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在
F
附加体编码
的高亲和力
lacIq
阻遏蛋白，
NovaBlue
为一个有用的严紧型宿主菌。此外，
Novagen
提
供了
λ
DE3
溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或
制备新的
λ
DE3
溶原菌的另一替代方法是通过
l
CE6
感染提供
T7
RNA
聚合酶。虽然
不如用
IPTG
诱导
λ
DE3
溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。
高严紧性
T7 lac
启动子
除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性，
pET
系统中
T7
启动子本身提供了两种不
同的严
紧性选择：普通
T7
启动子和
T7 lac
启动子。
T7 lac
启动子在启动子区下游
17bp
处含有一个
25bp
的
lac
操纵序列。
该位点结合
lac
阻遏蛋白能够有效降低
T7 RNA
聚合
酶的转录，
这样提供了在
λ
DE3
溶原菌中抑制基础表达的第二种基于
lacI
的机制
（除了
抑制
lacUV5
）
。含
T7
lac
启动子的
pET
质粒还具有它们自己的
lacI
，确保足够的阻遏
蛋白结合
到操纵基因位点上。
在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白
，通常应该测试多种不同的载体
/
宿主菌组合。
控制诱导的表达水平
在许多情况下，
表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、
培养条件和合适的载体
配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高
的条件不一致。除了根据载体
/
宿主菌
组合控制
T7 RNA
聚合酶的基础表达提供不同严紧性，
pET
系统还根据诱导物
（
IPTG
）
浓度，对目标蛋白表达提
供了真正的“变阻器”控制。
Tuner
和
OrigamiB
宿主菌的
lacY
突变使这种控制成为可能。
选择
pET
载体
所有的
pET
载体均来自
pBR322
，
但彼此间先导序列、
表达信号、
融合标签、
相关限制性
位点和其它特点有所不同。有
两大类
pET
质粒，即转录载体和翻译载体：
转录载体（包括
pET-21
、
pET-23
和
pET-24
）表达目标
RNA
，但不提供翻译信号。它
们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。
（注意：转录载体通过命名后面的一
个缺失字母后缀加以区分）
翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载
体在读码框
a
、
b
和
c
中
带有克隆位点，分别对应于
BamH I
位点的
GGA
、
GAT
和
ATC
三联体。
选择要点
选择用于表达的
pET
载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：
·
所表达蛋白的用途
·
所表达蛋白的已知信息
·
克隆策略
pET
载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变
体筛
选和定性、
筛选配体相互作用和抗原制备。
大量活性蛋白用于结
构研究、
试剂或亲和基
质制备。
许多载
体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，
然而只有载体、
宿主菌和培
养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。
如果需要
活性蛋白连续高产，
应该试验多种载体、
宿主菌和培养条件组合
以找到最优化结果。
任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。
例如，
< br>一些蛋白的活性要求一个或两个末
端没有外源序列。许多
pET
载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列
不能在
大肠杆菌中有效利用，
表达水平可能受影响。
在这些情况下，
常可用有效表达的氨基末端序
列构
建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。
LIC
（连接非依
赖的克隆）策略对
这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子
Xa
能够去除所有
氨基端载体编码序列。
由于限制性位点和读码框相容性的
需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多
pET
载体
具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆
到几个载体中。采
PCR
克隆策略时则有不同的考虑。
LIC
载体试剂盒推荐用于此目的，可通过
PCR
制备插入片
段，而不需要限制
性消化载体或插入片段。
溶解性和细胞定位
考虑了目标蛋白的
应用和克隆策略，
还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，
这
一点十分
重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。
特定目标蛋白的溶解性取决于多种
因素，
包括各自的蛋白序列。
在许多情况下，
< br>溶解性不是
有或无的现象，
载体、
宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比
例。
PET-32
载体系列使目标序列与通常能够增
加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白
( )
融合。
新推出的
pET-43.1
系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过
量表达时具有极高溶
解性的大肠杆菌蛋白
--
融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外，
trxB
突变株
AD494
和
BL21 trxB
，
或
trxB/gor OrigamiTM
和
OrigamiB
菌株可用于在胞
浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温
诱导（
15
-25
°
C
）也可
增加可溶性目标蛋白的比例。
获得可溶性活性蛋白的另一策略是
使蛋白外泌到胞外周质中，
为折迭和二硫键形成有更适宜
的环境
。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。
一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。
抽提包涵体并溶解，
然后目标蛋白在体
外重新折
迭
(
如使用
Novagen
的蛋白折迭试剂盒
)
。该过程通常产生高产量初始蛋白并
防止宿主细胞中的蛋白降解。
然而，
重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，
< br>可能
相当低。
pET-31b
（
+
）<
/p>
载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，
提供了生产小蛋白和多肽<
/p>
的有效方法。
满足不同需要的融合标签
如果融合序列不影响应用，
生产带有
、
a
、
a
和
a
的
融合
蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小）
，它们的检
测试剂极特异和灵敏。
通过使用
相应树脂和缓冲液试剂盒，
、
和
序
列可用于亲和纯化。
使用
和
分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。
采用一种新颖底<
/p>
物的
FRETWorks
分析试剂盒可通过荧光检测到少于
1fmol
的融合蛋白。
a <
/p>
序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来
说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。