表达质粒的构建

2021年2月28日发(作者：keely)

表达质粒的构建

一、表达载体的构建

表达载体是指 具有宿主细胞基因表达所需调控元件，能使克隆的基因在宿主细

胞内转录与翻译的载体。 也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞

内扩增

;

表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。外源基因在受体细胞内表达

与否及表达水平受到许多因素

(

调控元件

< p>
)

的制约。

1

、正确的阅读框架

外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致。

外源基因只有在它与载体

DNA

的起始密码相吻合时，才算处于 正确的阅读框架中，

从而表达融合蛋白，使外源蛋白与宿主蛋白相融合。

2

、目的基因有效转录的启动子

< /p>

启动子是

DNA

链上一段能与

< p>
DNA

聚合酶结合并能起始

mRNA

合成的序列，它是

基因表达不可缺少的重要调控序列。原核启动子是有两段彼 此分开且又高度保守的

核苷酸序列组成的，分别称为

-35

区和

-10

区。

- 35

区序列为

TTGACA

，

-10

区的序

列为

TA TAAT

。两序列之间的最佳间距为

17bp

< br>。可与

RNA

聚合酶结合，并指导该酶

< br>在正确的转录部位开始合成

mRNA

。由于细菌

RNA

聚合酶不能识别真核基因的启动

子，因此 原核表达载体必须用原核启动子带动真核基因在原核生物中转录。原核表

达载体启动子的 转录常常是可以控制的，一般情况下不转录，而受诱导剂诱导时就

能转录，带动外源基因 的高效表达。

(1)

大肠杆菌的

lac

启动子是乳糖操纵子的启动子，受

lac I

编码的阻遏蛋白

调节控

制

(2)

大肠杆菌的

trp

启动子是色氨酸操纵子启动子，受

trpR

编码的阻遏蛋白

调节控

制

(3) tac

启动子，由

lac

启动子的

-10

区和

trp

启动子的< /p>

-35

区融合而成，汇合

了

lac

和

trp

两者优点 ，是一个很强的启动子，受

lac I

编码的阻遏蛋白调节控制

(4) lacUV5

启动子是经紫外线诱变改造的

lac

启动子，该启动子失去了

CAP

和

< br>cAMP

的证调控，只要有乳糖或

IPTG

< p>
存在时就能够启动转录

(5)

噬菌体的

λP

启动子是

λ< /p>

噬菌体左、右向启动子，是一个温度敏感的阻

遏蛋、

LR

白受温度调控的很强的启动子

(6) T7

噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多，并且十 分专一，只被

T7RNA

聚

合酶所识别。

pET

宿主是大肠杆菌

< p>
BL21(DE3)

，

BL21(DE3)

是一株带有由

lacUV5

启动子控制的< /p>

T7

噬菌体

RNA

聚合酶基因的溶源菌。

3

、转录终止子

< br>为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因干扰表达载体的稳定性，一般要在多

克隆 位点的下游插入一段很强的核糖体

RNA

转录终止子。否则合成 的

mRNA

过长，

不仅消耗细胞内的底 物和能量，而且容易使

mRNA

形成妨碍翻译的二级结构。

4

、

mRNA

有效翻译的

SD

序列

< br>

在原核生物中，

mRNA

分 子上有两个核糖体结合位点也调节着

mRNA

的翻译，一

个是起始密码

(AUG

或

GUG)

，另一个是位于起始密码上游

3~11

< p>
个核苷酸处的由

3~9

个核苷酸组成的一段保守序 列

AGGAGGU

，称为

SD

序列。而核糖体和

mRNA

的结合是

< p>
由

SD

序列以及与起始密码

AUG

之间的距离决定的。

SD

序列 与

AUG

间隔

9

个碱基最

为合适。

5

、转录、翻译后的适当修饰和加工

6

、信号序列

*

融合蛋白的优点

:

融合蛋白

N

端由正常的大肠杆菌本身序列所控制，容易获得

< br>高效表达

;

融合蛋白往往不被大肠杆菌视为异己蛋白，更 为稳定。

*

在外源基因克隆到表达 载体时，应注意其序列的

ORF

的正确与否，他直接决

定其编码的氨

基酸的序列，并且直接影响蛋白 质的功能。如果

ORF

内碱基对发生缺失突变或

插入突变，即插入或缺失非

3

的倍数的碱基对，那么< /p>

ORF

就可能发生改变，而得到

一个截然 不同的蛋白质产物，这种变化就是移码突变。如果发生突变形成了终止密

码子，就会产生 提前终止的、不完整的蛋白质，即无意义突变。

*

为了使外源基因在原核细胞中高效表达，应利用蛋白酶缺陷型的宿主，如用

lon(

黄嘌呤核苷

)

营养缺陷型宿 主减少外源蛋白的降解，因为

lon

是大肠杆菌合成

< p>
蛋白酶的主要底物。

二、外源基因的诱导表达

外源基因 在原核生物中高效表达除了有合适的载体外，还必须有合适的宿主菌

以及一定的诱导因素 。

宿主菌的选择对外源基因的表达至关重要，因为外源基因 在细菌中的表达往往

不稳定，常常被细菌中的蛋白酶降解，有必要对细菌菌株进行改造， 使蛋白酶的合

成受阻，从而使表达的蛋白得到保护。实验中常用的宿主菌是经过改造的< /p>

JM109

、

BL21

< br>等大肠杆菌菌株。

通常表达质粒不应使外源基因始终 处于转录和翻译之中，因为某些有价值的外

源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的 过量表达必将影响细菌的生长。为

此，宿主细胞的生长和外源基因的表达是分成两个阶段 进行的，第一阶段使含有外