-
病理检验技术讲稿
一、组织切片常用仪器与制片技术
1
、切片机及使用
< br>切片机提供石蜡切片（或炭蜡切片）用，是切片中最常用的一种。超薄切片机的构
造与使用原理基本也属于这一类型。
（图
4-1-1
）
摇动轮的手柄转动重轮时，传动机内一组齿轮
及螺纹中轴，使中轴前端的组织块固
定架即按所调节的切片厚度（μ
m
）向前推进，并上下运动，让组织块经过前下方
的轮时，传动机内一组齿轮及螺纹中，使中轴前端的组织块固定架即按所在切片操作
，使中轴前端的组织块固定架即按所在切片操作
轴
前先打开卡锁，否则重轮不能转动。
然后，将组
织块固定于固定架，最后再装切片刀。
组织块及
切片刀先后装牢固后才可掀开卡锁。
慢慢转动重
轮使装有组织块的中轴稍下降到接近刀刃处，
调
整刀的前、后进度，使刀刃即将接触组织块。
调
整刀的进度时，不让刀刃接触组织块，
以免第一
次切到时崩落组织块。此时将组织进度调节器，调
节到
20
μ
m
，开始切片，待组织块切到所需的组织
图
4-1-1
旋转式切片机
断面时，再调节到所需
的切片厚度，如
5
μ
m
或其
它厚度。在装组织块前，可将组织蜡块予以修整
；如切成方形的断面使组织周围的空白
勿超过
1-3mm
宽，组织前面的蜡也尽量切去到能清晰看到组织本身，这样在切片机上
切片时可节省不少的切片时间。
在切片机上切片时，如发现因切片刀有缺口而致组织块<
/p>
出现划痕时，应稍向左、右移动切片刀避开切口，再正式切片。旋转式切片机一般不宜
切大块组织（不超过
1.8cm
）
，切片时转动重轮的速度也要均匀适宜，太快或太慢均不
易切成石蜡连续
切片带。结构优良的切片机可在组织块另行处理后能切成
1
μ<
/p>
m
厚的“半
薄切片”
。
切片工作结束后应先卡紧卡锁，再卸下切片刀，最后卸
下组织块，做其他处理。
任何切片技术工作者都应养成先卡紧
卡锁再在机上操作的良好习惯。这样就完全可
以避免切片刀伤人或砸坏组织块及切片刀的
事故发生。
2
、
脱水机
：
（图
4-1-2
）
< br>
脱水机是对动物标本按程序浸于各种溶剂进脱水、透明、侵蜡的精密仪器，根据
需
要，可分别使用不同功能的脱水机。生物组织自动脱水机的脱
水筐体积较大，能同时对
120
～
150
块组织
进行
脱水并且运转可靠，控温、定时准确，脱水效果
好，使用维修方便，特别是采用单缸揭盖技术，
减少了空气污染等功能。有的机器还有交直流电
源两用，市电停电后，由后备直流电源给整机供
电，完成脱水全过程；有的机器还设有延时加热
的功能，在组织入蜡缸前
4
小时自动开始加温，
即节约了能源，又延长了机器寿命。还有的机器
还编入了多套程序，
可供不同组织、
不同的制片
图
4-1-2
数显组织自动脱
水机
目的选择使用。
3
、切片制作技术
1
）
、取材
组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，
必须根据教学和科
研的具体要求
取自人体（外科手术切除标本、活检标本、尸检标本）或动物，并确定取材
的部位
和方法，否则对组织结构就看不全面。取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的
基本理论知识，
还要掌握实际操作技术，
每个组织器官的取材都有一定的部位和方
法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，
无法达到教学和科研的目的，具体要
求如下：
(1)
、材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好（人体组织一般在离体
2
小时以内取材）
，动
物组织
则应在处死后立即取材，并迅速固定，以保证原有的形态学结构。
(2)
、组织块的大小：所取组织块较理想的体积为
1.8
X1.0X0.2cm
，以使固定液能迅
速而均匀地渗入组织内
部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，
如制作病理外检、科研切
片，其组织块可以薄取
0.1
～
0.2
cm
即可，这样可以缩短固定
脱水透明的时间，若制作教学切片
报厚取
0.3
～
0.5cm
，这样可以同一蜡块制作出较多
的教学切片。
(3)
、勿挤压组织块
:
切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回挫动。夹取组织
时切勿过紧，
以免因挤压而使组织、细胞变形。
(4)
、规范取材部位
:
要准确地按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的胰腺尾
部；脊髓取腰
膨大与颈膨大处，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求
规范化取材。<
/p>
(5)
、
选好
组织块的切面
:
根据各器官的组织结构，
决定其切面的走向。
纵或横切往往
是显示组织形态结构的关键
，如长管状器官以横切为好。
(6)
、保持材料的清洁
:
组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪
便等，可用生理盐
水冲洗干净后入固定液。
< br>(7)
、
保持组织的原有形态
:
新鲜组织固定后，
或多或少产生收缩现象，
有时甚至完全
变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形。神经、肌肉组织等可将
其两端用线扎在
木片或硬纸片上固定。
(8)
、动物品种的选择
:
如观察肥
大细胞，以取材于大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网
膜组织直接作铺片为好；内耳、胰岛
细胞的观察，多取材于豚鼠的内耳和胰腺；运动终
板的观察多取才于小鼠的胁间肌。
2
）
、固定
（
1
）
、小块
组织固定法：从人体或动物体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂
中进行固定，标本
：固定液为
1
：
4
～
20
，这是最常用的方法，但组织块不易过大过厚，
否则固定液不能迅速渗透。故取组织块
的大小一般为
1.8X1.0X0.3cm
为宜。组织块厚
度不易超过
0.5cm
，如需厚度超过
0.5cm
，最好置入冰箱冷藏室内固定，冷藏固定时间
适当延长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。
（
2
）
、注射、灌注
固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需
要整个脏器或整个动物体
进行固定。
这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入
血
管，经血管分枝达整个组织和全身，从而得到充分的固定。
（
3
）
、蒸汽固定法：比较小而厚的标本
，可采用锇酸或甲醛蒸汽固定法。多用于涂
片、印片及压片标本的固定。如血液涂片，则
应在血片末干燥前采用锇酸或甲醛蒸汽接
触固定。操作时，应先将有盖玻璃容器内加入适
量
1-2%
锇酸水溶液或
10%
甲醛溶液，
将涂片标本放入高出固定液面
1c
m
以上的固定架上，待盖好容器盖后加温
55
< br>℃左右，
1
～
5
分钟即可。
常用的固定液有两大类即单纯固定液和混
合固定液，其种类繁多，最常用的单纯固
定液有
10%
甲醛固定和
95`%
乙醇固定液。最常用的混合
固定液有：
·酒精
-
甲醛固定液（
95%
酒精<
/p>
9
份、
40%
的
甲醛
1
份）
；
·
Zenken
氏液（重铬酸钾
2.5
克，升汞
5.0
克，蒸馏水
100ml,
冰醋酸
5
ml
）
；
·
Bou
in
氏液（苦味酸饱和水溶液
25
ml,40%
甲醛
25
ml
，冰醋酸
5
ml
）等。
3
、脱水透明
标本经过固定和冲洗后，
组织中含有较多的水分，
必须将组织
块内的水分置换出来，
这一过程叫做脱水。无论是用石蜡切片，还是用火棉胶切片，都必
须除去组织中所含水
分，因含水组织与石蜡、火棉胶等包埋材料不相容，常用的脱水剂为
一系列不同浓度的
乙醇。
脱水的步骤
是：
80%
、
90%
< br>、
95%
、
100%
各种浓度乙醇
2
小时，此过程可用脱水
机自控完成。
丙酮也是一种脱水能力很强的脱水
剂，但因其脱水能力很强，对组织有剧烈收缩作
用，在制作科研、教学切片时一般不用该
试剂。但因其沸点低，脱水力强，加温至沸点
时在短时间内可脱水彻底，故病理外检快速
石蜡切片时可用丙酮脱水剂。因乙醇、丙酮
等不溶于石蜡，
还要
经过一个能溶于石蜡的溶剂替代过程称为透明。常用的透明剂有二
甲苯、三氯甲烷、冬青
油等。
4
）
、浸蜡、包埋
（
1
< br>）
、浸蜡熔点：石蜡分为软石蜡与硬石蜡两种，熔点为
4
2
～
54
℃一般称为软蜡，
熔点为
56
～
62
℃称为硬蜡。浸蜡时，应先经软蜡再经硬蜡，
（常用的浸蜡熔点为
52
～
54
℃、<
/p>
54
～
56
℃、
56
～
58
℃
Ⅲ级浸蜡）
，使组织中含有的透明剂完全去尽。
（
2
）
、
< br>浸蜡温度：
浸蜡的温度应高于熔点的
2
< br>～
5
℃为宜，
温度过高可致组织
过度收
缩或变脆，如在温箱内浸蜡，要将温度控制在
60
～
65
℃的范围。
（
3
）
、浸蜡
的时间：可根据组织块的大小及其组织种类而定。一般厚度约
0.2cm
的
实质性器官（肝、肾、脾等）的浸蜡时间约为
2
～
3
小时，内窥镜镊取小标本的浸蜡时
间约
1
小时，组织块多时需增加浸蜡时间。
（
4
）
、包埋：将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在
其中，称
蜡块，
此过程称为包埋。
包埋用的石蜡和加温的镊子
均不能温度过高，
防止组织被烫伤，
破坏组织结构。包埋用的蜡
温度应与组织块本身的温度相等，如温度不一，可造成组织
与周围石蜡脱裂的现
象。包埋所用的石蜡要求无杂质，
并有一定的粘韧性。蜡的熔点与组织块相适应，
过硬的组织（如骨组织、肌肉组织、皮肤等）可
用，必要时加以过滤以免异物或残渣污染组织或损
害切片刀。组织包埋时亦可用包埋机操作
。
5
）
、切片和贴片
用硬度较高的石蜡包埋。包埋用的石蜡可以重复使
（
1
）
、修整蜡块：可视其组织的大小，在组织边缘
约
0.1-0.2cm
处，
切去余蜡部分，
否则易造成组织皱缩不平。
图
4-1-3
组织包埋机
（
2
）
< br>、准备好切片用具：磨好并经过镜检的切片刀、毛
笔、
眼科镊子（弯）
、单面刀、加温的水盆或切片漂烘温控仪、夏天须准备好冰块。
（
3
）
、安装蜡块：将修好的蜡块安装在金属或木制持蜡器上，如蜡块较多并较大可
直接安装在切片机的组织块夹持器中进行切片，但夹持器螺旋不能旋的过紧，否则蜡块
被
压裂。
（
4
）
、安装切片刀：将切片刀安装在切片机的刀台上，把刀台上的紧固螺丝旋紧，
使切片时不产生振动，能保持一定的切片厚度。
（
5
）
、切片刀与蜡块的角度：切片
刀与蜡块应有一定的角度，系指刀锋的下面和水
平面所形成的角称倾角又称清扫角。此角
若过大则切片上卷，过小则切片皱起。若用平
凹面刀，
则平的一
面必须向着蜡块，
凹面向外，
将预定使用的刀口部位移至蜡块的
下方，
调节蜡块夹持器的方向螺旋，使蜡块平切面与刀峰准确平行。刀的倾角一般以
4
°～
10
°
为宜，双平面刀侧角以
12
°～
15
°为宜，如切较硬的组织倾角以
30
°左右为宜。
（
6<
/p>
）
、切片的厚度：切片机的厚度调节器上刻有
0
～
50
μ
m
或
0
～
2
5
μ
m
，可任意选
择其厚度，石蜡切片的厚度一般在
4
～
6
μ
m
。
（
7
）
、切片
：用右手握住切片机旋转轮的手柄，左手握住微调推进器的手柄，调整
组织块前后的进度
，待组织块即将接触刀刃时，再用左手缓慢移动微调推进器的手柄，
右手上下移动旋转轮
的手柄进行“粗切”
，
待组织“切全”后，
松开左手，
以右手转动旋转轮，
石蜡便被切成一条蜡带，即
谓石蜡连续切片，这时左手持毛笔牵引着蜡带向前拉，到一
定长度便可用毛笔轻巧取下。
（
8
）
、
铺片：
用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在<
/p>
40
～
45
℃的
水面上，
借水的张力和水
的温度，将略皱的蜡带自然展平。
（
9
）
、贴片、烘片：待切片在恒温水面上充分展平后，用镊子将每一张蜡片分离，
将洁净的栽玻片垂直插入水中，
轻轻将其捞到栽玻片的中段处倾去栽玻片上的余水用
钻
石笔在载玻片的一侧写上标本的编号后放在烤片架上，置入
6
0
～
65
℃恒温箱内或切片
漂烘温控仪的烘箱内烤片
15
～
< br>30
分钟，脱去溶化组织间隙的石蜡即可染色。
6
）
、染色和封片
常用的染色方法是苏木素<
/p>
-
伊红
（
Hem
atoxylin Eosin
）
染色法
,
简称
H.E
染色法
.
这种
方法对任何固定液固定的组织和应用各种包埋法
的切片均可使用。
苏木素是一种碱性染
料
,
可使组织中的酸性物质
(
又称嗜硷
性物质
)
染成兰色，如细胞核中的染色质等；伊红是
一种酸性染料，
可使组织中的碱性物质
(
又称嗜酸性物质
)
染成红色，
< br>如多数细胞的胞质、
核仁等在
H.E
染色的切片中均呈红色，
很容易与胞核区别，
染色剂多为水
溶液，
故染色
前必须先经二甲苯脱蜡，
再用乙醇由高浓度到低浓度脱苯、
复水，
最后用流水洗去乙醇，
即可染色。
先用苏木素染细胞核，
用自
来水洗去切片上的染液，
再用
1%
盐酸
乙醇分色，
分色的目的是去除细胞核以外不应着色部分的颜色，使细胞核着色清晰适度。
颜色分辨
鲜明。分色时间凭经验控制。分色后用流水充分洗涤去除余酸。最后用
0.5%
的伊红液
染细胞质。染色后的切片，因
组织内含水而不透明，需再次用乙醇脱水、二甲苯透明。
为了达到长期保存的目的，
在切片标本上滴加树胶，
再加一盖玻片，
此
过程为封固。
H.E
染色程序如下
:
(1)
、脱蜡、脱苯、复水：
二甲苯
Ⅰ
1
分钟
二甲苯
Ⅱ
1
分钟
无水酒精
Ⅰ
30
秒
无水酒精
Ⅱ
30
秒
95%
乙醇
Ⅰ
30
秒
95%
乙醇
Ⅱ
30
秒
85%
乙醇
30
秒
75%
乙醇
30
秒
自来水洗
2-3
次
(2)
、染色：
苏木素染液
5-10
分钟
自来水洗
2-3
次
1
%
盐酸酒精（
80%
酒精）分化
15-60
秒
自来水洗
2-3
次
碳酸锂饱和水溶液
15-30
秒
自来水洗
2-3
次
(3)
、脱水、透明、封固：
80%
乙醇
15-30
秒
95%
乙醇
Ⅰ
15-30
秒
95%
乙醇
Ⅱ
15-30
秒
无水乙醇
Ⅰ
15-30
秒
无水乙醇
Ⅱ
15-30
秒
二甲苯
Ⅰ
15-30
秒
二甲苯
Ⅱ
15-30
秒
中性树胶加盖片将切片标本封固。
苏
木素染液的配制方法甚多，各有其不同的作用及特点，以下介绍两种常用的配制
方法。<
/p>
·哈瑞（
Harris
）氏苏木素液
苏木素
1
克
纯酒精
10
毫升
钾明矾（硫酸铝钾）
20
克
蒸镏水
200
毫升
氧化汞
0.5
克
先
将苏木素溶于纯酒精中，
另将钾明矾加温溶于蒸镏水中，
待钾明
矾全部溶解，
再将苏木素酒精溶液加在一起，混合后煮沸，避开火源缓缓加入氧化汞，用
玻璃棒
搅拌，
此时液体变为深紫色，
再
煮沸速将烧杯放于流动冷水之中，
使液体立即冷却，
隔日过滤。
使用时再加冰醋酸
4
毫升，可增加其染色力。也可将染液使用一
段时间
后再加入冰醋酸，这样可延长苏木素染液的使用寿命。
·
Gill
氏苏木素液
蒸馏水
146.00
毫升
乙二醇
50.00
毫升
苏木素
0.40
克
碘酸钠
0.04
克
硫酸
3.52
克
冰醋酸
4.00
毫升
混合后搅拌半小时，即可应用。此方法配制方便，使用效果同
Harris
氏苏木素
液。苏木素用量小
,
不需加温或煮沸
,
故称之为
Gil
l
氏苏木素液冷配法
.
附：伊红（曙
红
Eosin
）染液的配制法：
常规苏木素染色中的对比染色是用伊红
,
近
年来在英、
美国家的一些实验室则采
用焰红
（
phloxine
）
,
此外也有用桔黄
G
（
O
rangeG
）
、
比布里希猩红
(Biebrich scarlet)
、
波
尔多红
(Bordeaux red)
等作为对比染色。伊红为
染胞浆、胶原纤维、肌纤维、嗜
酸性颗粒等常用的染料。
它是一
种钠或溴盐的酸性染料。
伊红染液的配制比较简单：
水溶液为
0.5
～
1%
醇溶液为
0.5
～
1%
（
80%
乙醇）
二、组织化学技术与细胞化学技术
1
、糖类显示法
显
示多糖
和蛋
白多糖
常用
的方法
是过
碘酸－
雪夫
反应（
periodic
acid
Schiff
react
ion
，
PAS
反应）
。
●
试剂：
1%
过碘酸水溶液；
Schiff
●
材料：肝脏组织冰冻切片。
●
实验步骤：
氏液；亚硫酸溶液；苏木精或甲绿复染液。
< br>1
）
、肝脏切片入
95%
酒精
10
分钟。
2
）
、蒸馏水稍洗。
3
）
、
1%
过碘酸水溶液浸洗
10~15
分钟。
4
）
、蒸馏水洗数次。
5
）
、入
< br>Schiff
氏液作用
30
分钟
。
6
）
、亚
硫酸溶液洗
2~3
次，每次约
1
分钟。
7
）
、自来水充分冲洗（约
5
分钟）
，蒸馏水稍洗。
8
）
、苏木精复染
1~3
分钟或甲绿复染液复染
15
分钟。
9
）
、自来水冲洗、晾干。
10
）
、中性树胶封片
对照：可先用唾液淀粉酶滴于切片上，置
37
< br>℃作用
30
分钟
~1
小时，再按实验步骤
进行。
●
结果：
PAS
反应阳性部位可见
红色颗粒。对照片应为
PAS
反应阴性，证明阳性反
Schiff
氏液反应，
应物为糖原。
●
原理：含乙二醇基的糖类，经过碘酸氧化产生
双醛基，双醛基与
使无色品红变为紫红色沉淀物显现于含多糖部位。
附：
Schiff
氏液配制方法
1g
碱性
品红溶于
200ml
沸水，当冷却至
6
0
℃时，过滤。
过滤后加
1N HCl
20ml
，
亚硫酸氢钠
2g
，
塞紧瓶口过夜。
次日再加入
1g
活性炭，
摇匀，
过滤，滤液应
为无色透明，塞紧瓶口，置暗、冷处备用。染液变红则失效。
亚硫酸溶液配制方法：
10%
亚硫酸氢钠（或偏重亚硫酸钠）<
/p>
5ml
，
1N
HCl
5ml
，蒸
< br>馏水
90ml
。
2
、核酸显示法
●
甲绿－派洛宁法
甲绿－派洛宁（
Methylgre
en
－
Pyronin
）染色法是显示
核酸常用
的方法。
1
）
、试剂：
Carnoy
固定
液；甲绿－派洛宁染液
2
）
、材料：新鲜小鼠骨髓涂片或血涂片
3
）
、实验步骤：
（
1
）
、
骨髓涂片或血涂片在
Carnoy
固定液中固定
10~15
分钟。
（
2
）
、
80%
酒精浸洗
2~3
分钟。
（
3
）
、
蒸馏水洗数次。
（
4
）
、
入甲绿－派洛宁染液
30
分钟。
（
5
）
、
蒸馏水速洗，除去片上浮色，空气中晾干。
（
6
）
、
中性树胶封片或直接油镜观察。
<
/p>
对照：涂片固定后，先用核糖核酸（
RNA
）酶
37
℃消化
1
< br>小时再进行实验步骤，此
对照片上只显示脱氧核糖核酸（
DNA
）
。
4
）
、结果：
RNA
< br>呈红色，见于核仁和胞质中；
DNA
呈蓝绿色，见于细胞
核的染色
质。
5
）
、原理：甲绿和派洛宁均为碱性染料，它们可以分别与细胞内的
< br>DNA
和
RNA
结
合而呈现不同的颜色。甲绿易与聚合程度较高的
DNA
结合而使之呈绿色，派洛宁能与
聚合程度较低的
RNA
结合使之呈红色。
附：甲绿－派洛宁染液的配制方法
2%
甲绿液配制：原装甲绿一般都混
有甲基紫，
故配制甲绿－派洛宁染液前，必须先将甲基紫除去。方法是：取原装甲绿
3~5g
，溶于
100ml
蒸馏水中，入分液漏斗中，然后加适量的氯仿（甲绿液∶氯仿
=1
∶
1.5
）
，充分摇匀
,
然后静置，待氯仿呈紫色时，弃去氯仿部分，保留水溶液部分，如
此抽提甲基紫数次，
直至氯仿无紫色为止。将甲绿液保存于冰箱备用。
< br>5%
派洛宁液配制：
5g
派洛宁
加入
100ml
蒸馏水中，置
40
℃温箱中加温溶解，可以搅拌，待完全溶解后过滤备用。甲绿
－派洛
宁染液配制：
2%
甲绿水溶液
6ml<
/p>
，
5%
派洛宁水溶液
2ml
，
0.1mol
的醋酸盐缓
冲
液
16ml
，蒸馏水
16ml
，使用前临时混合。存于冰箱，可用数次。
●
Feulgen
反应
Feulgen
反应是用
来显示
DNA
的一种染色法。
1
）
、
试剂：
Carnoy
固定液；
Schiff
氏液
（配制同前）
；
亚
硫酸溶液；
1N HCl
；
0.5~1
%
亮绿。
2
）
、材料：新鲜小鼠骨髓涂片
3
）
、实验步骤：
（
1
）
、
骨髓涂片在
Carnoy
固定液中固定
10~15
分钟。
（
2
）
、
80%
酒精浸洗
2~3
分钟。
（
3
）
、
蒸馏水洗数次。
（
4
）
、
1N HCl
（室温）浸洗
3
分钟。
（
5
）
、
1N HCl
（
60
℃）水解
8~10
分钟。
（
6
）
、
稍冷却入
1N HCl
（室温）浸洗
2
分钟。
（
7
）
、
蒸馏水洗数次。
（
8
）
、
入
Schiff
氏液作用
30
分钟
~1
小时，
37
℃温箱中，应密盖染色缸，否则易
失败。
（
9
）
、亚硫酸溶液洗
3
次
，每次约
1.5
分钟。
（
10
）
、自来水洗
5~10
分钟。
（
11
）
、
0.
5%
亮绿复染
1~3
分钟
（
12
）
、水洗、晾干、封片或不封片直接油镜观察。
对照：
不经
HCl
水解，其它步骤相同，则呈阴性反应。或先用
DNA
酶水解，再按
实验步骤进行，也呈阴性
反应。
4
）
、结果：
DNA
呈紫红色，胞质呈绿色。
5
）
、
原理：
DNA
经
HCl
水解产生醛基，醛基与
Schiff
氏试剂结合形成一
种紫红色
沉淀物，因此染色后，胞核中有紫红色产物处，即
DN
A
所在之处。
3
、
脂类物质显示法
脂类物质包括
脂肪和类脂，染色方法很多，在此，仅介绍两种方法。
●
油红
O
中性脂肪染色法
油红
O
（
oil
red
）染色法是显示脂类物质常用的方法。
1
）
、试剂
：油红
O
染液；
Harri
氏或
Ehrlich
氏苏木精。
< br>
2
）
、材料：肾上腺冰冻切片
。
3<
/p>
）
、实验步骤：
（
1
）
、
冰冻切片用蛋白甘油贴于载玻片上。
（
2
）
、
切片经
60%
异
丙醇淋洗
30
秒
~1
< br>分钟。
（
3
）
、
浸入油红
O
稀释
染液
5~10
分钟。
（
4
）
、
60%
异丙醇分色至背景无色。
（
5
）
、
蒸馏水速洗。
（
6
）
、
Harri
氏或
Ehrlich
氏苏木精复染
3~5
分
钟。
（
7
）
、
1%Na2HPO41~2
分钟使胞核变
蓝。
（
8
）
、
蒸馏水洗。
（
9
）
、
甘油明胶封片。
< br>4
）
、结果：脂滴橘红色，磷脂粉红色，胞核蓝色。
附：油红
O
染液
配制方法
原液：油红
O0.6g
，异丙醇（
99%
）
100ml
。稀释液：
油红
O
原液
20ml
，蒸
馏水
20ml
，过滤后使用。
●
类脂苏丹黑
B
染色
法
苏丹染料也是脂类物质染色常用
的试剂，苏丹黑
B
（
Sudan
black B
）染色效果最佳，尤以染磷脂较好。对粒细胞颗
粒和细胞内微细结构染色好。
1
）<
/p>
、试剂：苏丹黑
B
染色液；
Wright
氏染液或
1%
番红花红水液。
2
）
、材料：大鼠肾上腺冰冻切片。
3
< br>）
、实验步骤：
（
1
）
、
切片以
10%
甲
醛固定
10~30
分钟。
（
2
）
、
蒸馏水洗
1~2
分钟。
（
3
）
、
入苏丹黑
B
染色
液中染色
30
分钟
~1
小时。
（
4
）
、
蒸馏水略洗，晾干。
（
5
）
、
入
Wright
氏染液
5~8
分钟或
1%
番红花红水液
5~10
分钟。
（
6
）
、
蒸馏水速洗，滤纸吸干。
（
7
）
、
70%
酒精分色
1~3
分钟。
（
8
）
、
95%
酒精和无水酒精分色与脱水各
30
秒
~1
分钟。
（
9
）
、
晾干后甘油明胶封片。
4
）
、结果：类脂呈黑色或蓝黑色，胞核紫蓝色（
Wright
氏染色）或红色（
1%<
/p>
番红
花红染色）
。
5
）
、原理：苏丹黑
B
为脂溶性染料，染色后与组织中的脂类物质结合，故组织中含
脂类物质处呈黑色。
附：苏丹黑
< br>B
染色液配制方法
苏丹黑
B
保存液：苏丹黑
B 0.15g
溶于
50ml
无水<
/p>
酒精，摇匀，放置
2
天，时常摇动，使苏
丹黑
B
完全溶解。碳酸磷酸缓冲液：石碳酸结
< br>晶
8g
，
无水酒精
15ml
，
混合溶解；
磷酸
氢二钠
（
Na
2
HPO
4
12H
2
< br>O
）
0.15g
，
蒸馏水
50ml
，
混合溶解
；此二液混合即成缓冲液。苏丹黑
B
染色液：苏丹黑
B
保存液
40ml
，碳酸
磷
酸缓冲液
20ml
，混合过滤即可使
用。
3
、
酶组织化学方法
酶是一大类特殊的蛋
白质，在生物化学反应中起催化剂的作用。利用这种特性，使
酶促反应的终产物形成有色沉淀物，
从而检测酶在组织中的定位
、
活性和定量变化的组
织化学方法即酶组织化学方法。
●
显示碱性磷酸酶的钙钴法
在人体内碱性磷酸酶（
Alkaline
phosphtase,
AlP<
/p>
）主
要分布在中性粒细胞、近曲小管和部分血管内皮细胞。
1
）
、孵育液：
3%
β
-
甘油磷酸钠
5ml
2%
巴比妥钠
5ml
蒸馏水
10ml
2%CaCl
2
10ml
2%MgSO
4
1ml
------------
----------------------------------------
31ml
上液用
1N NaOH
将
pH
调至
9.3
～
9.4
。
2
）
、材料：肾脏冰冻切片
3
）
、实验步骤：
（
1
）
、
肾冰冻切片用冷丙酮或
95%
酒精固定
15
分钟。
（
2
）
、
蒸馏水洗数次，约
1~2
分钟。
（
3
）
、
入预温的
37
℃
孵育液中孵育
4
～
6
< br>小时。
（
4
）
、
自来水洗数次。
（
5
）
、
2%
硝酸钴中浸
3~5
分钟。
（
6
）
、
蒸馏水洗数次。
（
7
）
、
1%
的硫化铵中
2
分钟。
（
8
）
、
自来水冲洗。
（
9
）
、
2%
甲绿复染
10~15
分钟，流水冲
洗。
（
10
）
、晾干，封片。
对照：孵育液中去
掉β
-
甘油磷酸钠。
4
）
、结果：阳性部位呈棕黑色或黑色，细胞核呈绿色
。
5
）
、原
理：β
-
甘油磷酸钠在碱性磷酸酶的作用下水解（
pH9.3
～
9.4
）产生
磷酸根，
磷酸根与孵育液中的钙离子结合成磷酸钙，与硝酸钴反应产生磷酸钴，
磷酸钴与硫化铵
反应形成棕黑色硫化钴沉淀。
●
显示酸性磷酸酶的铅法
酸性磷酸酶
(Acid
phosphatase,AcP)
主要分布于巨噬细胞
< br>等一些具有吞噬分解能力的细胞。
1
< br>）
、孵育液：
蒸馏水
74ml
0.5mol
醋酸缓冲液（
pH4.7
）
12ml
5%Pb
（
NO
3
）
< br>2
2ml
3.2%
< br>β
-
甘油磷酸钠
4ml
---------------
----------------------------------
92ml
上液用前现配并用
1N HCl
将
pH
调至
4.7
。
2
）
、材料
：血涂片或组织冰冻切片
3
）
、实验步骤：
（
1
）
、
血涂片或冰冻切片用冷丙酮或
95%
酒精固定
15~30
分钟。
（
2
）
、
蒸馏水洗数次，约
1~2
分钟。
（
3
）
、
入预温的
37
℃
孵育液中孵育
2
小时。
（
4
）
、
蒸馏水洗数次。
（
5
）
、
1%
的硫化铵中
3
分钟。
（
6
）
、
自来水冲洗。
（
7
）
、
2%
甲绿复染
1
0~15
分钟，流水冲洗。
（
8
）
、
晾干，封片。
对照：孵育液中去掉β
-
甘油磷酸钠。
4
）
、结果：阳性部位呈棕色或
棕黄色，细胞核呈绿色。
5
）
、原理：β
-
甘油磷酸钠在酸性磷酸酶的作用
下水解（
pH4.7
～
5.0
）产生磷酸根，
磷酸根与孵育液中的硝酸铅反应产生磷酸铅，磷酸铅与硫
化铵反应形成棕色硫化铅沉
淀。
●
显示碱性磷酸酶的萘酚
AS-
BI
法
1
）
、
孵育液：
萘酚
AS-BI
原液
萘酚
AS-BI
磷酸
< br>2.5mg
，
N
∶
N
’－二甲基甲酰胺
1ml
，
蒸馏水
1ml
，
1mol
碳酸钠
1~2
滴。上述液
体顺序加入，摇匀，用
1mol
碳酸钠调
pH
至
8.0
，然后加入下液：蒸馏
水
30ml
，
0.2mol
tris
盐酸缓冲液
pH8.3
18ml
。孵育液
萘酚
AS-BI
原液
< br>10ml
，坚牢红
TR10mg
，混合过滤后立即使用。
2
）
、材料：肾脏冰冻切片
3
< br>）
、实验步骤：
（
1
）
、
肾冰冻切片用冷丙酮或
95%
酒精固定
15
分钟。
（
2
）
、
蒸馏水洗数次，约
1~2
分钟。
（
3
）
、
入萘酚
AS-BI
< br>孵育液室温孵育
5~10
分钟。
（
4
）
、
蒸馏水速洗。
（
5
）
、
入
2%
甲绿复染
3~5
分钟。
（
6
）
、
蒸馏水速洗，晾干。
（
7
）
、
甘油明胶封片。
对照：去掉萘酚
AS-
BI
或坚牢红。
4
< br>）
、结果：阳性部位为红色，胞核为绿色。
5
）
、原理：萘酚
AS-
BI
磷酸在
pH8.3~9.2
的环境
下，被碱性磷酸酶水解的产物与坚
牢红结合为红色沉淀物。
●
显示酸性磷酸酶的萘酚
AS-
BI
法
1
）
、
孵育液：
萘酚
AS-BI
原液
萘酚
AS-BI
磷酸
< br>50mg
，
N
∶
N
’－二甲基甲酰胺
5ml
。
氯偶氮付品红原液
六偶氮付品红
1g
，蒸馏水
2
0ml
，盐酸
5ml
。亚硝酸钠液
亚硝酸
钠
0.4g
，
蒸馏水
10ml
。
< br>Veronal
醋酸缓冲液
pH5.0~5.5
。
孵育液
萘酚
AS-BI
原液
< br>0.5ml
，
氯偶氮付品红原液和亚硝酸钠液的混合液<
/p>
0.8ml
，
Veronal
醋酸缓冲液
2.5ml
，蒸馏水
< br>6.5ml
。用
0.1N NaOH
调
pH
为
4.7~5.0
。
2
）
、材料：肝脏冰冻切片。
3
）
、实验步骤：
（
1
）
、
冰冻切片用冷丙酮或
95%
酒精固定
15
分钟。
（
2
）
、
蒸馏水洗数次，约
1~2
分钟。
（
3
）
、
入萘酚
AS-BI
< br>孵育液
37
℃孵育
30~40<
/p>
分钟。
（
4
）
、
蒸馏水速洗。
（
5
）
、
入
2%
甲绿复染
3~5
分钟。
（
6
）
、
蒸馏水速洗，晾干。
（
7
）
、
甘油明胶封片。
对照：去掉萘酚
AS-
BI
或六偶氮付品红。
4
）
、结果：阳性部位呈红色，细胞核呈绿色。
<
/p>
5
）
、原理：在
pH
为
4.7~5.0
的环境中，酸性
磷酸酶水解萘酚
AS-BI
磷酸的产物与
六偶氮付品红和盐酸的反应产物氯偶氮付品红结合形成红色的沉淀物。
●
显示脱氢酶的四唑盐法
脱氢酶是催化氧化还原反应的一大类酶，如琥珀酸脱氢酶
（
SDH
）
和乳酸
脱氢酶
（
LDH
）
，
显示方法相似，
反应底物不同。
在此，
仅介绍显示
SDH
的四唑盐法，
SDH
主要分布于线粒体。
1
）
、孵育液：磷酸缓冲液
1/15mol Na
2
HPO
4
80.4ml
，
1/15mol KH
2
PO
4
19.6ml
，
配成
1/15mol
磷酸缓
冲液，
pH
调至
7.4
。孵育液
0.2mol<
/p>
琥珀酸钠
15ml
，
1/15mol
磷
酸缓冲液
15m
l
，
0.1%
的硝基蓝四唑（
NBT
）
15ml
。孵
育液用时现配，必要时可过滤。
2
）
、材料：肝脏冰冻切片。
3
）
、实验步骤：
（
1
）
、
冰冻切片用冷丙酮固定
1~2
分钟。
（
2
）
、
蒸馏水略洗。
（
3
）
、
浸入孵育液
37
℃孵育
1~2
小时。
（
4
）
、
蒸馏水略洗。
（
5
）
、
1%
沙黄
O
复染
1~2
分钟。
（
6
）
、
蒸馏水速洗，晾干或吸干。
（
7
）
、
甘油明胶封片。
< br>对照：切片经
10%
甲醛处理
5
分钟，则
SDH
反应阴性。
4
）
、结果：
SDH
阳性部位呈深蓝色，核呈红色。
5
）
、原理：在
SD
H
催化的氧化还原反应中，氢的供体把氢原子传递给受氢体，然
后由受氢体把氢原子传递给四唑盐，使四唑盐转变为蓝色的产物。
4
、
免疫组织化学方法
以往显示蛋白质的
方法有很多，如，汞－溴酚蓝法、坚牢绿法和茚三酮－
Schiff
反
应等。免疫组织化学方法（
immunohistoch
emistry
）是利用抗原抗体特异结合的原理，
用标记抗体与组织中的蛋白质抗原结合从而对蛋白质进行定性
、
定位乃至定量研究的组
织化学技术。
免疫组织化学方法应用到组织化学之后，
以其定性、
定位准确和
灵敏度高、
特异性强等优点而逐渐成为显示蛋白质的最常用、
最
可靠的组织化学方法。
其他方法则
很少再被采用了。
免疫组织化学的方法很多。根据标记物的性质可分为如下几种：
●
疫荧光法（
immunofluor
escence
technique
）
。
●
疫酶法（
immunoperoxidase
technique
）
。
●
免疫金银法（
immunogold
technique
）
。
●
ABC
法（
avidi
n-biotin complex
technique
）
。
●
其他方法：如放射免疫法等。
此外，根据染色及抗体滴加的步骤，又可以分为直接法、间接法和桥法等。在此仅
介绍较常用的
ABC
法。
1
）
、试剂：兔抗鼠Ⅳ型胶原抗体（一
抗）
；生物素标记羊抗兔抗体（标记二抗）
；亲
和素
-
生物素
-
过氧化物酶复合物（
ABC
）
；
3,3-
二氨基联苯胺四盐酸盐（
DAB
）显色液；
0.3%
过氧化氢（
0.01mol PBS
配制，含
40
%
甲醇）
。抗体的稀释度应照产品说明试行。
< br>
2
）
、材料：小鼠小肠冰冻切
片
3
）
、步骤：
冰冻切片蒸馏水略洗。
0.3%
过氧化氢
,
室温，
20
分钟，封闭内源性过氧化物酶。
0.01mol PBS
（
pH7.4
）充分洗，两次，每次
10
分钟。
正常羊血清（
1
∶
20
）
，室温，
20
分钟。
0.01mol P
BS
（
pH7.4
）洗三次。
一抗孵育，
4
℃，过
夜。
0.01mol PBS
（
pH7.4
）洗三次。
< br>标记二抗孵育，室温，
1
小时。
0.01mol PBS
（
pH7.4
）洗三次。
亲和素
< br>-
生物素
-
过氧化物酶复合物（
ABC
）
，孵育，室温，
1
小时。
0.01mol
PBS
（
pH7.4
）洗三次
DAB
显色液处理，室温，
< br>5
～
30
分钟。
蒸馏水洗
脱水、透明、封片。
对照：
PBS
取代一抗或省略一抗。
4
）
、结果：含Ⅳ型胶原部位呈棕黄色。
5
）
、原理：一抗与待测
抗原结合后，生物素标记二抗与一抗结合，
ABC
复合物与标<
/p>
记二抗结合，
DAB
显色液处理后，在<
/p>
ABC
复合物中过氧化物酶的作用下过氧化氢与
< br>DAB
反应产生棕色沉淀。
附
：
DAB
显色液的配制方法
DAB
原液：
DAB 1
～
1.5mg
溶于
5ml
0.05mol Tris-HCl
缓冲液
（
< br>pH7.6
）中，室温遮光，
磁力搅拌器搅拌，
完全溶解后过滤。
0.5%
过氧化氢液：
0.1ml
过
氧化氢原液
（
30%
）
入
6ml
蒸馏水，
混匀，
密封。
DAB
显色液：
取
0.05ml 0.5%
过氧化氢液加入到
DAB
原液即为
DAB
显色
液，用前现配。
6
、电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术是在细胞超微结构原位，通过化学反应原理显示化学成分的技术
方法。常用的有电镜酶细胞化学法和电镜免疫细胞化学法。由于操作复杂，不易掌握，
在此仅介绍两种，供参考。
●
电镜酶细胞化学技术
酶的种类很多，
不能一一论述，
仅介绍显示酸性磷酸酶
（
AcP
）
的电镜酶细胞化学法：
1
）
、孵育液：
< br>1.25%
β
-
甘油磷酸钠（<
/p>
Ph5.0
）
1ml
0.1mol Tris-maleate
缓冲液（
Ph5.0
）
1ml
蒸馏水
1ml
滴加
0.2%
硝酸铅，边加边搅
2ml
---------------------------
-------------------------------------------
5ml
2
）
、材料：分层液密度梯度离心法收取外周血单个核细胞悬液
。
3
）
、步骤：
（
1
）
、
用
1.5%
戊二醛
（
0.1mol
二甲砷酸钠缓冲液
pH
7.4
配制）
4
℃固定
1
～
2
小时。
（
2
）
、
0.1mol
二甲砷酸钠缓冲液
pH7.4
（含
7%
蔗糖）
4
℃洗
5
分钟。
（
3
）
、
细胞悬液离心
1500rpm
，
5
分钟，
共两次，
中间用
0.1mol
二甲砷酸钠缓冲液
pH7.4
（含
7%
蔗糖）
4
℃洗。
（
4
）
、孵育液中
37
℃孵育
10~30
分钟。
（
5
）
、清洗液
4
℃洗
40
～
60
分钟。
清洗液：
0.2mol Tris-
maleate
缓冲液
pH5.0
12.5ml
蒸馏水
37.5ml
蔗糖
4.2g
50ml
细胞悬液离心
1500rp
m
，
5
分钟，清洗液清洗，再离心。<
/p>
制细胞团块：用
9%
< br>血清白蛋白液稀释细胞，在塑料尖试管（
ependob
管）中离心
10000rpm
，使细胞凝聚成细胞团块。
取出细胞团块，用
1%OsO
4
中后固定
4
℃
30
～
60
分钟。
脱水、包埋、制备电镜标本。
对照：去底物；加
NaF
抑制。
< br>
4
）
、结果：反应产物呈棕黑
色，电镜下电子密度高。主要分布溶酶体。
●
电镜免疫细胞化学技术
又简称免疫电镜。原理与免疫组织化学相似，但标记抗体
常用铁蛋白、胶体金或酶标。根据染色与包埋的次序不同，又可以分为包埋前法和包埋
后法。在此，仅介绍金标包埋后法。
1
）
、试剂：牛血清白蛋白（
BSA
）
；
Triton
x
100
；
Tris
缓冲液，
pH7.4
（
TBS
）<
/p>
；特
异一抗；金标记抗一抗的二抗。
2<
/p>
）
、材料：待检组织戊二醛短时间固定，制成电镜标本，捞在无支
持膜的镍网或金
网上。
步骤：
将标本置
1~10%
的
H
2
O
2
液滴中处理
10
分钟。
生理盐水洗
5
分钟。
正常羊血清（
1
∶
5
）
5
分钟。
一抗室温
2
小时。
0.05mol
TBS
（
Tris
缓冲液，
pH7.4
，含
0.5%Triton x100
）洗
5
次。
0.02molTBS
（
pH8.2<
/p>
，含
0.1%BSA
）洗
5
分钟。
正常羊血清（
1
∶
5
）
5
分钟。
金标记二抗
（
1
∶
10
）
染
10
分钟。
0.02molTBS
（
pH8.2
，含
0.1%BSA
）洗
5
分钟。
0.05molTBS
< br>（
Tris
缓冲液，
pH7.4
，含
0.5%Triton x100
）先喷射洗后浸洗
5
分钟，
洗三次。<
/p>
2%
戊二醛及
3%
多聚甲醛的
TBS
溶液固定
30
分钟。
蒸馏水
洗
5
分钟，洗三次。
5%
醋酸铀染色，遮光，
5
分
钟。
蒸馏水洗
5
分钟，洗三次。
枸橼酸铅染色
5
分钟。
0.02N
NaOH
洗。
蒸馏水洗
5
分钟，洗三次。干燥后电镜观察。
注：蒸馏水为三蒸水。
结果：待检抗原阳性部位聚集金颗粒，阴性部位无金颗粒。
三、细胞培养仪器应用与技术
1
、细胞培养室的设置及仪器应用：
●
细胞培养室的设置：
细胞培养室的设计应具备有防止微生物污染及其他有害因素影响的功能。保持工作
环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。因为基础条件各有不同，细胞培养室的设置可采
用多种方案。如仅有一两个较大的房间，
可以用划分不同功能区或用铝合金隔板隔开的
方法进行安排。实验操作和观察活动可在同一室内，而清洗和消毒最好安置在另室中。<
/p>
在具有充足空间条件下或新建研究室时，
各实验室应有单独的房间
，但各部门最好分别
设置于相连的各个房间，便于工作。理想的无菌操作室应划分为更衣
间、缓冲间及操作
间三部分。工作人员可在细胞培养室完成无菌操作、培养液配制、洗刷
、无菌处理、细
胞温育以及细胞和用品储存等工作。
●
净化工作台
净化工作台也称超净工作台，是目前国内外最普遍应用的无菌操作装置。即使在没
有单
独的无菌操作室的情况下，
只要安装了超净工作台。
也能基本上
满足简单的细胞培
养操作。一般的
细胞培养室多使用两种净化工作台，一种是侧流式或称为垂直式；另一
种外流式或称为水
平层流式。其基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，
由离心风机压入静压
箱，
再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流从一定均匀的
断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。
一般在使用净化工作台时应注意以下几点：
< br>1
、
净
以
降
1
）
）
、
净
化
化
工
工
作
作
台
台
安
安
装
装
在
在
清
< br>清
洁
洁
无
无
尘
尘
的
的
房
房
间
间
内
内
，
，
以
免
免
尘
尘
土
土
过
< br>过
多
多
易
易
使
使
滤
滤
器
器
阻
阻
塞
塞
，
，
降
低
低
净
净
化
化
效
< br>效
果
果
，
，
缩
缩
短
短
使
使
用
用
寿
寿
命
命
。
。
2
）
、新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须
对工作台和周围用不产生纤维的
用具或用真空吸尘器进行清洁工作，然后使用药物灭菌法
或紫外线灭菌法进行灭菌处
理。
3<
/p>
）
、每次使用净化工作台，都应先用
75
%
酒精擦洗台面，并提前用紫外线灭菌灯处
理净化工作区内积累
的微生物
30
—
50
< br>分钟，在关闭灭菌灯后应启动送风机使之运转两
分钟后再进行培养操作。
4
）
、净化工作区内
不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰。
5<
/p>
）
、应定期将粗过滤器中的过滤布拆下清洗，通常间隔
3
—
6
个月进行一次。一
旦
感到气流变弱，
如酒精灯火焰不动，
加大电机电压也不见情况改变则说明滤器已被阻塞，
应及时更换。
一般情况下高效过滤器三年更换一次。
更换高效过滤器应请专业人员操作，
以保持密封良好。
6
）
、
净化台在每次使用后都要及时清除工作台面上的物品，
并用酒精擦洗台面使之
始终保持洁净。
●
二氧化碳培养箱
< br>体外培养的细胞和体内细胞一样，
都需要在恒定的温度下才能生存，
大多数情况下，
最适温度是
37
°
C
，稳定温度变化一般不应超过±
5
°
C
。细胞在温度升高
2
°
C
时，持续数
小时即不能耐受，
40
°
C
以上将很快死亡。因此需要有能控制温度的培养箱，如恒温培
养箱及二氧化碳培养箱。
二氧化碳培养箱已成为普遍应用的设备，
< br>优点是箱内能恒定地
提供一定的二氧化碳，通常用
5%<
/p>
，可使培养液维持稳定的
pH
，减少调<
/p>
pH
的麻烦，适
用于开放或半开放培养。
用二氧化碳温箱培养细胞，培养容器需与外界保持通气状态，
因此需用培养皿、培养板、
或用螺帽培养瓶将瓶盖旋松半圈或用消毒棉堵塞的办法，以
保持通气，因此箱内空气应保
持干净。箱内有紫外灯时，应定期进行消毒，如无紫外灯
时，可定期用酒精擦拭消毒的办
法，以减少箱内微生物。此外箱内尚需水槽以维持箱内
温度、
湿
度和避免培养液蒸发，
槽内应为无菌蒸馏水并应加无腐蚀性和无挥发性的防腐
剂，以防生霉。
●
倒置相差显微镜
< br>细胞培养观察常用倒置相差显微镜。它的光源和聚光器在载物台的上方，物镜在载
物台的下方，便于观察贴附于培养器皿底壁上的活细胞。活细胞无色透明，一般光学显
微
镜不易分辨。使用相
差显微镜的特点是将活细胞不同的厚度及
细胞内各种结构对光产生的不同折射作用，
转
换为光密度差（明
暗差）
，使镜下结构反差明显，图象清楚。实验室日常使用具备显微
照相系统的相差显微镜，
<
/p>
一方面了解细胞生长和细胞污染情况，以便及时做各种处理，另一方面随时摄影、记录
细胞生存
状态，以便制定下一步研究计划。
2
、培养技术与观察
●
培养用具的清洗与消毒灭菌
细胞培养工作需要大量的用品，虽然国际上对于很多
器材已趋向一次性使用，
但是目前在我国很多实验室因条件所限尚未普遍
采用，仍需要
反复使用各种器材，
特别是玻璃器皿。因此在细胞
培养工作中清洗和消毒灭菌仍是一项
极为繁重而艰苦的工作，
其
主要目的是去除器皿上杂质和对细胞生长有影响的物质以及
各种微生物。
1)
、培养用具的清洗
<
/p>
在细胞培养中，离体细胞对任何有害物质都十分敏感，包括微生物、细胞残余物以
及非营养成分的化学物质，因此对新的和用过的培养器皿，都要严格清洗。细胞培养器
皿清洗的要求比普通实验用器皿要高，而且每次实验后，器皿都需要及时清洗，因此清
洗的工作量很大，
有必要使用高效率的清洗工具，
如
超声波清洗机、
虹吸式吸管冲洗器、
培养瓶喷淋器等。因为器皿
的材料不同，所以清洗的方法和程序也有所不同，因此要分
别处理。
（
1
）
、玻璃器皿的清洗
一
一
般
般
玻
玻
< br>璃
璃
器
器
皿
皿
的
的
清
清
洗
洗
包
包
括
括
：
：
浸
浸
泡
泡
、
、
刷
< br>刷
洗
洗
、
、
浸
浸
酸
酸
和
和
冲
冲
洗
洗
四
四
个
个
步
步
骤
骤
，
，
< br>清
清
洗
洗
后
后
的
的
玻
玻
璃
璃
器
器
皿
皿
要
要
求
求
干
干
净
净
透
< br>透
明
明
、
、
无
无
油
油
迹
迹
，
，
且
且
不
不
能
能
残
残
留
留
任
任
< br>何
何
毒
毒
性
性
物
物
质
质
。
。
浸
初
以
浸
泡
泡
：
：
初
次
次
使
使
< br>用
用
和
和
培
培
养
养
用
用
后
后
的
的
玻
玻
璃
璃
器
器
皿
皿
都
都
需
< br>需
先
先
用
用
清
清
水
水
浸
浸
泡
泡
，
，
以
使
使
附
附
着
着
物
物
软
< br>软
化
化
或
或
被
被
溶
溶
掉
新
并
掉
。
。
新
的
的
玻
玻
璃
璃
器
器
皿
< br>皿
在
在
生
生
产
产
过
过
程
程
中
中
常
常
使
使
玻
玻
璃
璃
表
表
面
面
< br>呈
呈
碱
碱
性
性
，
，
并
带
带
有
有
一
一
些
些
如
如
铅
铅
和
和
砷
砷
< br>等
等
对
对
细
细
胞
胞
有
有
毒
同
因
新
毒
的
的
物
物
质
质
，
，
同
时
< br>时
玻
玻
面
面
常
常
带
带
有
有
很
很
多
多
干
干
涸
涸
的
的
灰
灰
尘
尘
< br>，
，
因
此
此
使
使
用
用
前
前
必
必
须
须
彻
彻
底
底
清
清
洗
洗
。
。
< br>新
瓶
瓶
应
应
先
先
用
用
自
自
来
来
水
水
进
进
行
行
简
简
单
单
刷
刷
< br>洗
洗
，
，
然
然
后
后
用
用
5
5
%
%
的
的
稀
稀
盐
盐
酸
酸
浸
浸
泡
< br>泡
过
过
夜
夜
，
，
以
以
中
中
和
和
碱
碱
性
性
物
物
质
质
。
。
使
使
< br>用
用
后
后
的
的
玻
玻
璃
璃
器
器
皿
因
干
皿
应
应
立
立
即
即
浸
浸
入
< br>入
清
清
水
水
中
中
，
，
因
培
培
养
养
后
后
的
的
玻
玻
璃
璃
器
器
皿
< br>皿
往
往
往
往
附
附
有
有
大
大
量
量
的
的
蛋
蛋
白
白
质
质
，
，
干
涸
< br>涸
后
后
不
不
易
易
刷
刷
洗
洗
掉
掉
。
。
浸
浸
泡
泡
时
时
注
注
意
意
< br>要
要
让
让
水
水
完
完
全
全
进
进
入
入
瓶
瓶
皿
皿
中
中
，
，
不
不
应
< br>应
有
有
气
气
泡
泡
存
存
留
留
。
。
刷洗
：
浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质的洗涤剂
（如高级的洗衣粉）
进行刷洗，
以去除器皿表面上附着较牢的
杂质并避免损害器皿表面的光泽度。以免影响细胞的生
长。刷洗时注意不要用力过猛，并
应特别注意瓶角等不易刷洗到的死角部分。最后将洗
涤剂用清水冲净、凉干。
浸酸：没有刷洗掉的极微量的杂质要经过硫酸和重铬酸钾清洁液浸泡过夜
（不能少
于
6
小时）
< br>，才能被除掉。清洁液具有很强的氧化作用，对玻璃器皿无腐蚀作用，去污
能力很
强。浸泡时注意器皿要充满清洁液，不能留有气泡。配制清洁液时要注意安全，
穿戴耐酸
的手套和围裙，防止损伤皮肤和烧伤衣服。
清洁液可根据需要配制成三种不同的强度，配制方法见表：
重铬酸钾（
g
）
浓硫酸（
ml
）
蒸馏水（
ml
< br>）
弱液
100
100
1000
次强液
120
200
1000
强液
63
1000
200
配制时要先将重铬酸钾完全
溶解在水中，然后慢慢地加入浓硫酸，配制的容器宜用
陶瓷或塑料器皿，以免因加入浓硫
酸产生太多的热量，导致容器破裂，发生危险。
冲洗：浸泡后
的玻璃器皿必须用流水冲洗，每个器皿都要用流水灌满、倒掉，至少
需重复十次以上，清
洁液必须冲洗干净，不留任何残迹。然后再用蒸溜水洗
2
—
3
次，
最后用三蒸水洗一次。在烤箱内烘干
备用。
（
2
）
、胶塞、瓶盖的清洗
细胞培养过程
中使用的胶塞、培养瓶的盖子不能用清洁剂浸泡。新购买的胶塞因带
有大量的滑石粉，应
先用自来水冲洗干净后，再做常规清洗。常规清洗的方法是：每次
用后的胶塞、瓶盖应及
时浸泡在清水中，以便集中处理，避免附着物干涸在上面，然后
放入
2%NaOH
中煮沸
10
—
20
分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗干净，再用
1%
的稀盐酸浸泡
30
分
钟，
最后用自来水冲洗，
蒸溜水漂洗
2
—
3
次，
三蒸
水漂洗
1
次，
凉干备用。
（
3
）
< br>、培养用品的消毒灭菌
包装处理：培养用的物品在消毒
前都必须要经过包装处理，目的是防止消毒灭菌后
再次被污染，也方便消毒、储存。一般
使用的包装材料是皱纹纸、牛皮纸、硫酸纸、棉
布、
铝饭盒、<
/p>
金属制的消毒筒等。
比较大的器皿如装培养液用的盐水瓶、
培养瓶、
滤器、
消毒筒等只把瓶口部分用硫酸
纸包裹后再罩以牛皮纸然后用线绳扎紧即可。
较小的培养
器皿、
注射器、金属器械、胶塞等现多采用装入铝饭盒的方法，但因密封不严所以使用
期限不宜
过长，又因不透明所以需在盖上写明物品名称。吸管在装入消毒筒前，应先用
少许脱脂棉
将吸管接口堵塞，松紧要适宜，过紧不透气，过松易脱落。然后再装入消毒
筒内，注意消
毒筒的底部应垫以棉花或软纸以防碰坏吸管，最后再包装入筒中封口。
消毒灭菌：通过消毒灭菌技术防止微生物的污染至关重要。造成细胞培养失败的主
要原因之一，就是发生细菌、真菌、病毒等微生物的污染。培养基对于细胞的体外生长
是必不可少的，而对微生物来说也是非常好的营养物。微生物比细胞生长的快，而且产
生
的毒素会直接影响细胞的生长甚至会引起细胞的死亡。这里重点讨论消毒灭菌的方
法。<
/p>
消毒灭菌的方法一般分为二类，物理方法、化学方法。物理方法
包括：干热、湿热、
紫外线、射线、离心、过滤等手段。化学方法包括化学消毒剂和抗菌
素。
干热灭菌：一般用于玻璃器皿消毒。主要在烤箱中进行。
由于干热传导慢，因此需
要较长的时间和较高的温度，一般需加温到
160
°
C
并保持
90
—
120
分钟才能杀死细
菌
芽胞达到消毒灭菌的目的。消毒完毕后注意不要立即打开烤箱门，
以防冷空气突然进入
引起玻璃炸裂，发生危险。
湿热灭菌：
即高压蒸汽灭菌，
是最有效的消毒方
法。
主要使用高压蒸汽灭菌锅进行。
布类、金属器械、玻璃器皿
、胶塞及某些培养液均可用此法消毒灭菌。消毒时注意要保
证消毒锅内的气体能够流动，
且勿装的过满影响消毒效果。在加热升温之前，应先打开
<
/p>
排气阀门，
待消毒器内的冷空气排出后，
再关闭排气阀门开始生压。
当达到所需压力时，
可通过调节火焰
大小，保持压力稳定在所需数值后开始计算时间。
各种物品要求的有效消毒压力和时间如下表：
压力（磅）
时间（分钟）
布类、玻璃器皿、
金属器械
15
20
培养液、
橡胶制品
10
10
紫外线消毒：紫外线直接照射法是当前各实验室常用的消毒方法。主要用于消毒空
气、操作台表面以及一些不能用其它方法进行消毒的物品如塑料培养皿等。
培养室内的
紫外线灯应离地面
2.5
米高，并保证各处能够达到每平方厘米
0.06
微瓦的照射能
量，
否则消毒效果不理想。有人测定紫外线照射
20
、
40
、
60
分钟后。空气中细菌数分别下
降
71%
、
79%
、
86%
。说明经过一定时间的照射后，空气中的大部分细菌可以被消灭。
由于
紫外线照射产生臭氧，照射不到的地方起不到消毒作用。
因此消毒时物品不可以相
互遮挡，同时也不宜在紫外线照射的时候进行操作，因紫外线对细胞以及人体皮肤都有
伤害。
滤过法除菌：人工合成的培养液、血清
以及酶溶液在高温情况下易发生变性，因此
不宜采用高压消毒的方法来进行灭菌处理。必
须使用滤过法除菌。常用的滤器有
Zeiss
滤器、微孔滤膜滤
器和各种规格的一次性滤器。目前各实验室多采用
Zeiss
滤
器，此滤
器为不绣钢结构，中间可夹一层由混合纤维制成的一次性滤膜，使用后丢弃即可
。滤器
清洗起来比较方便：先用自来水冲洗，再用软毛刷沾洗涤剂刷洗，然后用自来水冲
净，
蒸溜水漂洗
2
—
< br>3
次，三蒸水漂洗
1
次，晾干并
包好备用。使用前放上一张新的滤膜，
注意不要旋的太紧。消毒后应在无菌条件下将旋纽
拧紧。
化学消毒剂及抗菌素：常用的化学消毒剂有
75%
酒精、
0.1%
新
洁尔灭、来苏儿、
0.5%
过氧乙酸、乳酸等。主要用于一些无
法用其它方法消毒的物品。如
75%
酒精可用
< br>于皮肤消毒和器械的浸泡消毒，
由于其对活细胞有很小的毒性，因此还可用于瓶皿
开口
的消毒。
0.1%
新洁尔灭是目前
细胞培养室常用的消毒剂，操作台面、皮肤以及器械都
可用它浸泡和擦拭消毒，效果很好
。
0.5%
过氧乙酸只需
10
分钟即可杀灭芽胞菌，用擦
拭或喷洒的方式对各种物品的表面进行消毒。
乳酸蒸气用于空气消毒很有效，消毒时在
一开口较大的容器内放
入少许乳酸，
用酒精灯加热使之挥发，
使乳酸蒸气充满于整个房
间，达到消毒灭菌的作用。来苏儿对皮肤有刺激，不宜用作皮肤消毒剂。
在细胞培养中也常使用抗菌素，主要用于消毒培养液，青霉素和链霉素是比较
常用
的抗菌素。
但需要注意的是不能完全依赖抗菌素达到消毒灭
菌的作用，
它只能起到辅助
功效。
●
细胞培养技术
1
）
、上皮细胞类的培养
因为癌症源于上皮组织，所以上皮细胞的培养格外引人注意。
培养上皮细胞有比较
困难的三点：第一，需要特殊的培养底物；第二，需要特殊的培养基
；第三，成纤维细
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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