-
形态学研究技术
一、
显微镜介绍
（
PPT
3~18
）
二、
固定
（
PPT
19~20
）
三、
组织切片
（
PPT
21~25
）
四、
组织染色
（
PPT
26~30
）
五、
免疫组织化学
< br>/
免疫细胞化学
（
PPT
31~56
）
六、
荧光染料
（
PPT
57~65
）
七、
定量分析
（
PPT
66~77
）
八、
应用
（
PPT
78~88
）
九、
电子显微镜
（
PPT
89~102
）
一、
显微镜的介绍
★四种光学显微镜：<
/p>
亮视野；相差；微分干涉相差；暗视野
（用的非常少，比如原位杂
交中同位素标记的
点是亮的，用暗视野显微镜在暗背景下看到的亮点会更清楚）
★倒置显微镜
：可
操作空间大，可以做电生理等实验，最常用的观察方法是相差，由于此方法不需要染色，
因此是观察活细胞的理想方法，分辨率不如正置
组成和普通显
微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，倒置
显
微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放
大镜可以具有更高的放大率而已。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不 是物
体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。
★体视显微镜：
视野大可作精细解剖
和
/
或胚胎，分辨率不如正置
1
．
双目镜
筒中的左右两光束不是平行的，而是具有一定的夹角——体视角（一般为
12
度
---15
度）
，因此
成像具有三维立体感；
2
．像是直立
的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把像倒转过来的缘故；
3
．虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长
4
．焦深大，便于观察被检物体的全层。
5
．
视场直径大。
★荧光显微镜：光源是汞灯
,
有滤镜。固定后的细胞、组织
用荧光染料；活体细胞用荧光蛋白。
荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：
< br>1.
照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；
2.
光源为汞灯紫外光，波长较短，分辨力高于普通显
微镜；
3.
有两个特殊的滤光片，
光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，以保护人目。
（荧光素的标记只是作为一种指示剂，不像电子显微镜下面看到的是真实物体，要真正敲定某
种物质的
location
只能借助电镜）
★共聚焦显微镜
< br>：
（结构，原理）光源不是汞灯
,
是激光器，
（注：在观察的时候，使用汞灯为光源，拍摄的
时
候使用激光器）与普通的
CCD
成像不同
,
普通的
CCD
成像杂光多，不清
晰，颜色是真彩
,
共聚焦显微镜的
颜色
是伪彩（同一个激光器有几个不同的波长，可据荧光素选择具有需要波长的激光器。不同于普通荧光
显微镜激发光是某一波段内的光，激光器发出的是某一特定波长的光，能量集中，功率大。
）
从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到
被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原
透镜
应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜
(CLSM
或
LSCM)]
在反射光的光路上
加上了一块半反半透镜，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔
(Pinhole)
，
小孔就位于焦点处，挡板后
面是一个光电倍增管
(photomultiplier tube
，
PMT)
。可以想像，探测光焦点前
后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的
反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。
★成像系统
1
digital camera imaging
system(CCD)
（真彩）
○
CCD
的真实名称为电荷耦合器件
，工作原理是
CCD
将光线转换成模拟电压信号，并且标出每个
象素的灰度
级，再由一个模数转换器将模拟电压信号转换为数字信号，每种颜色使用
8
、
10
或
12
位来表示，逐点扫描
后，通过扫描图像专
用格式保存在电脑里。成像过程中，光源发出的光必须经过镜片的反射和透镜的聚焦，
且
得到的图像是真彩。
2
共聚焦成像<
/p>
-----
激光共聚焦显微镜（伪彩）
○
有小孔，分辨率高，但进入的光量也少，需在两者间达到平衡
；不是
CCD
那种全量，而是只扫描某个部分，
得到的
pic
每张都在焦点上，可以叠加；得到的灰
白
pic
可以人为赋予各种颜色。
二、
固定
★
固定的目的和作用
若想得到理想的染
色结果、正确地判断抗原物质在组织细胞内的位置，除需有良好的酶和抗体外，保
持组织
细胞内抗原物质的不动性（
immobility
）和免疫活性
也是至关重要的。
固定的目的在于迅速终止酶的活性，避免组
织细胞结构的解体，阻止细胞内外肽类和蛋白质的扩散移
位，增强组织细胞对标本制作过
程中各种有害影响的对抗作用，总之，在于达到固定抗原和保存组织细胞
形态结构的目的
。
尤其是保持抗原分子上有限数目氨基酸顺序和抗原决定簇的完整性，保持抗原分子三维
空间构型的稳定性以便于结合特异性抗体。尤其是大多数神经激素和肽类物质，因为具有
水溶性，在进行
免疫组织化学研究之前，常常需要固定处理。但是肽类物质和蛋白质的物
理化学性质不同，因而对不同的
固定剂或者固定方法的适应程度也不尽相同。某些固定剂
甚至可以同时破坏和
/
或保护同一抗原物质的不同
抗原决定簇。因此，在进行免疫组织化学研究的时候，先要了解所研究物质（如蛋白质和肽类）的化学
性
质，再根据需要来选用适宜的固定剂或固定方法，改进固定的条件。
< br>
★固定剂
选择最佳固定液的标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构；②最大限度地保存抗原的免疫活性。<
/p>
值得注意的是免疫组织化学技术中禁用含重金属的固定液。
免疫组织化学研究中常用的固定剂：
交联固定：多聚甲醛、戊二醛（
glutaraldehyde
）
沉淀固定
:
乙醇、甲醇、丙酮（
acetone
）
细胞可选择的固定液多，一般固定
10min
～
20min
。
★
pH
：较多中性固定液（
PH 7.4
）
，有时也会用酸性或碱性固定液
用不同的磷酸缓冲液配制
PFA
（多聚
甲醛）
，得到酸、中、碱性固定液。
★
固定的时间：长
< br>,
对组织结构有好处
,
但对抗原
不一定好；组织固定时间最好在
l2h
内，一般固定时间不
应超过
24
小时。随着固定时间的延长对组
织抗原的检出强度将逐渐降低。
★常用的固定方法有两种：浸入法和灌注法。
浸入法即将组织浸泡在固定液内
（必要时在
4
℃下）
，
固定时间根据抗原的稳定性以及固定液
的性质而定，
一般在
2-12h
之间。
灌注法主要适用于动物研究；灌注
固定可以使固定液迅速到达全身组织充分固定。
★
Procedure
（灌注
,
浸泡
,
后固定）
★
蔗糖（
10%
、
20%
、
30%
）
-----
高渗的蔗糖溶液，能够置换出水，所以可作为冰冻切片前的冻融保护
。
1
冰冻切片时的冻融保护
，
○
2
提高染色时抗原
的浓度。
蔗糖脱水的作用：
○
★固定时应注意
力求保持组织新鲜，勿使其干燥；
组
织块不宜过大过厚，组织块厚度必须控制在
0.3cm
以内；固
定液必须有足够的量，在体积上一般大
于组织
20
倍以上，否则组织中固定不良而影响效果；
组织固
定后，应充分水洗，去除固定液，以减少固定液造成的人为假象。
三、切片
★冰冻切片
是免疫组织化学中最常用
的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定
的抗原（如检测
细胞膜的某些抗原成分）
，但标本来源受限。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片
。
冰冻切片时
,
组织中水分易形成冰晶
,
影响抗原定位。冰晶小而多，对组
织结构损害大。因此可采用
以下措施减少冰晶的形成：
①速冻，
缩短组织从
-33
～
< br>-43
℃的时间。
（用干冰或液氮，
但液氮易使组织冻裂）
②将组织置于
20%-30%
蔗糖溶液中
1-3
天，利用高渗吸收组织中水
分，减少组织含水量。
冰冻切片一般用恒冷切片机。切片后如
不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，进行短暂预
固定干燥后贮存于低温。
1
不用任何包埋
,
迅速
,
薄
,
4
～
5
μ
m,
可以保存很长的时间
冰冻切片优缺点
：○
2
缩短了制片时间
○
3
抗原性不受损失
○
4
对稳定性
差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。
○
★石蜡切片：
在冰冻切片染色不好的情况下可选用石蜡切片，可作抗原修复。
抗原修复：组织在制作过程中
,
由于化
学试剂的作用
封闭了抗原
，又由于热的作用致使部分抗原的肽链
发生
扭曲
,
致使在免疫组化的染色过程
中不能将其显示出来，为了解决上述的问题
,
利用化学试剂和热
的作用
将
这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程
称为抗原修复。
在制作
切片或超薄切片时，由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片是困难的。
所以有必要用一定物质浸透组织内部，整个组织一样硬化，以利于切成薄片，这种物质叫做
包埋剂。
包埋
：就是将已经固定，脱水，透明，浸蜡的组织快从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，
包
埋成块，使组织和包埋剂相容一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后，进
一步加强了组织的
硬度和韧度而便于进行切片。
1
石蜡切片是制作组织标本最常用、
最基本的方法
石蜡切片的优缺点
：○
2
最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染
色对照观察；
○
3
石蜡块还能长期存档，供回顾研究。
○
4
石蜡切片制作过程对组织内抗原显
现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，
○
因而它是大多
数免疫组化中首选的组织标本制作方法。
HE
染色石蜡切片制作的基本过程（了解）
1
、取材与固定
：
?
从人或动物新鲜尸体上取下组织块
(<
/p>
一般厚度不超过
0
．
5
厘米
)
投入预先配好的固定液中
(10
％福尔马林，
Bouin
氏固定液等
)
使组织、细胞的蛋白质变性凝固
，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞
本来的形态结构。
2
、脱水透明
：
一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐
渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于
石蜡的透明剂二甲苯中透明
，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
3
、浸蜡包埋
：
将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保
温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好
容器
(
如折叠一小纸盒
)
，倒入已溶化的石蜡，迅速
夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。
包埋好的组织块变硬，才能在切
片机上切成很薄的切片。
（生物秀实验频道
）
4
、切片与贴片
：
?
将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为
5
—
8
微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热
的水
中烫平，再贴到载玻片上，放
45
℃恒温箱中烘干。
5
、脱蜡染色
：
?
常用
HE
染色，以增加组织细胞结构各部分
的色彩差异，利于观察。苏木精
(Hematoxylin
，<
/p>
H)
是一种碱性染
料，可将细胞核和细胞
内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红
(Eosin
，
E)
是一种
酸性染料，
能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去
切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。
HE
染色过程是：
< br>?
①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色
数分钟。
?
②酸水及氨水中分色，各数秒钟。
?
③流水冲洗
1
小时后入蒸馏水片刻。<
/p>
?
④入
70
％和
90
％酒精中脱水各
10
分钟。
?
⑤入酒精伊红染色液染色
2
—
< br>3
分钟。
6
、脱水透明
：
?
染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。
7
、封固
：
?
将已透明的切片滴上加拿大树胶
，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。
★振动切片
用振动切片机（
Vibratome
）
，可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成厚片
20
～
100
μ
m
，以漂浮
法在反应
板进行免疫组织化学染色，然后在解剖显微镜下检出
免疫反应阳性部位，修整组织进行后固定，最后按电
镜样品制备、脱水、包埋、超薄切片
、染色观察等。
组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏
，在免
疫组
化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能较好地保留组织内脂
溶性物质和细胞膜抗
原，主要用于显示神经系统抗原分布研究。这种包埋前染色，尤其实
用于免疫电镜观察。
应用：一是做电镜
,
常温最薄切到
50
μ
m
；
二是做漂片
,
即切一些厚的片子
,
把它漂在容器里染色
,
使两面都可以浸透；
三是做脑片
,
但与做电镜的横向
的切片机不同
,
要用
垂直的振动切片机
。
水平振动切片机
：室温下切，组织
软，可得的比较厚的切片；可做漂片，两面都可以染色。
垂直
振动切片机
：垂直切割，得到的切片上细胞可正常存活，可做脑片。
四、组织染色
★
普通的组织染色：苏木精和伊红染
色（
HE
染色）
< br>苏木精
：
碱性染料
,
结合组织的酸性化合物
,
染出的是
蓝～紫色
。
嗜碱性的核
,
细菌
,
钙
等
被苏木精染成
蓝色
.
时间长
伊红：
酸性染料
,
结合组织的碱性化合物
,
被伊红
染色的结构呈粉～红色。
伊红对细胞质、肌纤维、胶原
纤维具有
着色性。
★
特殊染色：其他细胞结构只有特殊染色后才能被光学显微镜识别
.
（如用尼氏染色染尼氏小体）
★
尼氏染色
(Nissl stain
)
将
RNA
和
DNA
染成紫色。在神经元细胞质上的尼氏小体被认为是核糖体和糙面内
质网。这种染色将尼氏小体染成紫色。
★
衬染：非特异性背景染色。
HE
染色（苏木精
-
伊红染色）
染料的染色原理：
（
1
）化学作用：染料的性质有酸、碱、中性之别，那么组织中的碱性
部分（如细胞质）
易和酸性染料亲和而发生作用，组织中的酸性部分（如染色质）易和碱
性染料亲和而发生作用。
（
2
）物理<
/p>
作用：指吸附或溶解作用。组织蛋白和某些染料有相互吸附的作用。
媒染剂、促染剂和分化剂
媒染剂
：某些天然染料（如苏木精）
，
本身无
着色性，要与其他物质结合后才具有着色性
，这些被结合的物
质
称为媒染剂，如许多铁盐、铬盐及钾盐等。
促染剂
：是促进染料着色性的物质，如冰醋酸是伊红的促染剂。
分化剂
：能使切片上需要显示的结构清晰，而使不需要显示的结构脱去颜色的物
质。如
1%
盐酸酒精。
一、苏木精
-
伊红染色（
H
.E
染色）
所做出的石蜡包埋切片可
应用的染色方法很多，应根据不同的检查目的而选用不同的染色方法。而最为常
用的染色
法为
H.E
染色。
< br>1
、苏木精
(
苏木素、苏木紫<
/p>
)
（
hematoxylin
）
：为从苏木中提取。苏木精本身不是染料，不能直接染色，必
须经氧化才能染色。可以在空气中自然氧化，但需时很长，所以一般都是加氧化剂（如碘酸钠）氧化 。同
时，被染材料又须经媒染剂作用后才有着色能力，所以在配制苏木精染液时，都加有
媒染剂。苏木精液主
要着染细胞核。
有数种不同配方的苏木精液。
May
er(
梅耶
)
氏苏木精液：
苏木素
1g
硫酸铝钾
50g
（媒染剂）
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