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临床实验室质谱检测原理简介
临床实验室质谱（
mass
spectrometry, MS
）技术在临床实验室中的应用随
着
MS
分析仪的创新不断拓展。最早的
MS
分析仪采用扇形电场及磁场实现
质量分离
,
体积大、价格贵。随着四极杆
MS
分析仪与色谱分离、第
1
代气
相色谱
（
gas chromatography, GC<
/p>
）
及液相色谱
（
liquid chromatography,
LC
）技术的联用
,
大大提升了
MS
技术的实用性。三重四极杆等多重
MS
技
术的联用与
LC
分离技术令检测向高敏、可重复、定量方向发展
,
这是目前临
床实验室开展
MS
检测的基础
[1]
。随着
MS
分析仪的不断发展及轨道阱
（
Orbi
trap
）
MS
分析仪的诞生
, LC-MS
的联用更是如虎添翼。
采用
GC/MS
对类固醇
[2]
及有机酸
[3]
进行检测是
MS
技术最先在临床实验室
应用的项目
。
继串联
MS
检测酰基肉碱诊断新生儿
遗传代谢病
（
inborn error
of metabolism,
IEM
）
后
,
其在临床检测中的应用开始加速
[4]
。
LC-MS
联用
尤其是与串联四极杆
MS
联用时
,
能实现对小分子药物
及其代谢产物的量化
检测
,
促进了该
领域仪器研发的进步
[5]
。治疗药物监测与毒理学的迅速发展
在提升仪器灵敏度及实用性的同时
,
进一步扩大了
MS
技术的应用范围
[6
]
。
1
仪器
1.1
MS
分析仪类型
MS
分析仪可对单个分子或分子片段进行质量分析
,
要求被分析对象带电荷
并呈气相
, <
/p>
一般由紧密相连的离子源、质量分析器及检测器
3
个部分组成。
离子源外接样品引入系统
,
是离子生成的部位
;
多数
MS
分析仪的质量分析
器根据离子质荷比（
mass-to-charge ratio,
m/z
）区分离子
;
检测器将离子<
/p>
分别转换成信号并传入仪器数据处理系统
,
由数据处理系统控制整个仪器。
MS
技术具有较高的特异性
,
尤其在与可重复色谱分离技术联用时
,
其检测结
果可作为许多临床检测的“
金标准”
。
也就是说
,
该技术可作为其他特定分子
浓度检测手段的校准方法。仅当某方法被作为参考方法且检
测严格按照书面
程序进行时
,
可将液相色谱串联质谱（
liquid
chromatography
tandem-mass
spectrometry, LC-MS/MS
）作为“
金标准”
。但由于
< br>MS
分析仪系统复杂、维持其精密度以获得准确的结果亦具有一定难度
, MS
技术
常被视作“
无其他方法可用时的最佳技术”
。
MS
分析
仪根据
m/z[
离子质量（相对原子质量）÷
< br>
电荷数
]
分析被测物的质
量。例如
, 25-
羟基维生素
D3
的相对原子质量为
400,
当加入
1
个质子
[
（
400+1
）个质子
]
而带单电荷时
,
可在
m/ z
为
401
处被检测到
;
当加入
2
个质子而带双电荷时
[
（
400+2
）个质子
,
402/2 = 201],
可在
m/z
为
201
处
被检测到。通常以
m/z
衡量准确度
,
检测越准确则分子式鉴定能力越强。仍
以
25-
羟基维生素
D3
为例
,
其分子式为
C27H44O2,
分子
离子经质子化后的
相对原子质量为
401
（加入
1
个质子形成
C27H45O
2
）
,
其精确质量保留至
5
位小数
,
为
401.341 97
。
尽管经质子化的
C27H45O2
（
25-
羟基维生素
D3,
m/z
为
401.341 97
）与
C28H49O
（菜油甾醇
, m/z
为
401.370
52
）之间的
质量差异仅为
0.028
55,
但
MS
技术仍可通过
m/z
精确区分两者。
检测误差
决定了质量检测结果所对应的潜在分子式的数量。
高分辨质谱仪（
high
resolution mass
spectrometer, HRMS
）能精确离子
m/z<
/p>
。
整体准确性及有效位数层面的质量检
测能力是区分不同类型
MS
分析仪的标
准之一。为提升整体准确性
, MS
分析仪常采用四极杆作为质
量过滤器。四极
杆由
4
根杆组成
,
以相对的
2
根杆
为
1
组
,
通
过在
2
组杆上施加相抵消的直
流电高频
电压来实现质量过滤。
许多
MS
分析仪
都可提供准确的质量信息
,
如
检测加
速离子飞行时间的飞行时间（
time of flight, TOF
）
MS
分析仪
[7, 8],
检测捕获离子振荡频率的分析仪—
—
利用磁场捕获离子的傅里叶变换质
谱
分析仪（
Fourier transform mass
spectrometer, FTMS
）与通过经典吸引
平衡
离子惯性进行捕获的轨道阱
MS
分析仪
[9, 10, 11]
。
多重
MS
技术的联用令
MS
分析仪能够在离子水平上同时进行多项临床实验。
由
3
个紧密联系的四极杆分析仪组成的三重四极杆较为常用
,
其常见的工作
模式见图
1[12]
。
最简单的模式是全扫描
,
在质量分析器设定的扫描范围内采
集生成的全部离子的信号
,
Q1
与
Q3
同时进行扫描
, Q2
设置为所有离子可通
过、不含碰撞气体
,
见图
1
（
a
）
;
产物离子
扫描可对不同质量的分子进行定
量检测
, Q1
设置为仅特定
m/z
的离子可通过
, Q2
中充入碰撞气体令离子碎
片化
,
Q3
对片段产物进行扫描
,
见图
1
（
b
）
;
母离子扫描可用于确定一类待
测物中的所有
母离子
,
识别共同碎片并观察产生该碎片的所有母离子
,
由
Q1
进行扫描
,
在
Q2
中通过碰撞气体使离子碎片化
, Q3
仅识别特定
m/z
的离子
,
该模式可检测单个样品中所有糖基化类型
,
< br>见图
1
（
c
）
;
与母离子扫描相近
的是中性丢失扫描
,
该模式对
Q1
与
Q3
同时进行扫描
,
将两者质量抵消偏移
,
Q2
中充入碰撞气体进行离子片段化
处理
,
可通过观察
m/ z
为
18
（
相当于水）<
/p>
处的中性丢失情况来识别所有含羟基的离子
,
< br>见图
1
（
d
）
;
选择反应监测
（
selected
reaction monitoring, SRM
）
为一种
三重四极杆分析仪常用的模
式
,
可用于定量分析
, Q1
与
Q3
用于质量分析
,
Q2
通过碰撞气体进行碎片化
反应
,
见图
1
（
e<
/p>
）。
SRM
进一步升级即为多重反应监测
（
multiple reaction
monitoring, MRM
）
,
MRM
以
SRM
为基础
,
利用数据控制系统循序选择多
重反应类别。当
MS
分析仪连接色谱分离入口时
,
该模式尤显重要。多重母
子离子对即母离子与碎片离子的组合
,
可在特定时间内对色谱洗脱出的特定
待测物
进行监测。如采用化学性质与待测物相同的同位素标记标准品
,
则标
准品与待测物的母子离子对同样可通过
MRM
进行监测。各母子离子对的观
察时间短且与色谱层析图谱峰宽相关
,
可准确测量峰面积并计算待测物浓
度。
SRM
与
MRM
的
特异性大幅提升了试验信噪比
,
提高了灵敏度。
串联四极杆可与精密质量仪联用
,
较常见的包括
Qq-
TOF
、
Qq-
FTMS
与
Qq-
Orbitrap[Q
代表扫描四极杆
, q
< br>代表碰撞（碎片）四极杆
]
。这类仪器可
运行上述所有模式
,
其检测结果更为准确。
1.2
离子化
MS
分析均以离子为基础
,
故待测物经
MS
分析仪检测前需进行离子化
,
是
MS
检测的
基本操作。
MS
分析仪采用过各类离子源
,
不断推陈出新
,
就像许
多
MS
分析仪曾风靡一时但如今不再使用一样
。
目前
,
临床实验室
< br>MS
检测常用的是
LC
技术
, LC-MS
检测最常涉及的电离方
式有
3
种：电喷雾电离（
electros
pray ionization, ESI
）、大气压化学电离
（
atmospheric-pressure chemical
ionization, APCI
）及大气压光电离
（
atmospheric-pressure photoionization, APPI
）
。
（
1
）
ESI
最为常用
,
尽
管工作机制尚未完全明确
, <
/p>
但重要的是
ESI
过程始于对预制离子液
的雾化
[13]
。液滴随着溶剂分子的“
挥发”
而不断收缩
,
直至库仑爆炸令其碎片
化。
该过程持续至溶剂完全去除
,
留
下带电离子经过锥孔（大小需满足维持分析
过程中的真空需求）进入
MS
分析仪。同轴气流可辅助雾化
,
附加气流利于
溶剂蒸发
,
两者均可提高流速。
电喷雾常产生多种带电离子
,
增加电荷数量可
提升
MS
分析仪的有效检测范围。（
2
）
APCI
采用
LC
流出物气流辅助
喷射
技术
,
通过电晕针放电令溶液分子产生活性成分
,
使待测物分子质子化或去
质子化
, <
/p>
生成
MS
分析所需的带电物质。
（
3
）
APPI
同样采用气流辅助雾化
,
但
通过紫外线光源对待测物直接电离
,
或对掺入喷雾的助剂分子进行电离从而
使待测物离子化。
尽管
APPI
仅适用于含芳香基团的特定类型
待测物
,
但其信
噪比极佳
,
< br>故分析灵敏度非常高。这
3
类离子化技术均可与其他类型
流体色
谱法联用。
ESI
与
APCI
常产生质子化分子离子
,
通过向待测物添加
1
个质子
（
H+
）来观察带正电荷的离子
, <
/p>
或通过分子离子去质子化（去除
H+
）来
观
察带负电荷的离子。
APPI
常通过
丢失
1
个电子产生激发态阳离子。
这<
/p>
3
类离
子化技术均属于“
软”
电离技术
,
主要产生准分子离子
,
通过检测待测
物中
所有特定
m/z
的离子来提高其灵
敏度。
GC
是与
MS
< br>分析仪最早进行联用的
色谱技术
[14, 15],
在临床实验室已有较丰富的应用经验
,
但该技术如今已不
及
LC
运用普遍。
GC/MS
采用电子轰击
（
electron impact, EI
）
电离技术
,
优
势在于不同仪器所获得的结果重复性较好
,
能提供大量信息
,
可外接数据库
能辅助鉴定化合物。
与
APCI
相似
,
GC
亦可向离子源中加入附加反应物
,
使其
离子化并反应生成可与待测物进一步反应的物质
,
经质子化或去质子化形成
带正电荷的阳离子或带负电荷的阴离子。这
种离子化形式亦称化学电离
（
chemical
ionization, CI
）
,
可减少化合物碎片质量的差异
,
常用于测定未
知物质的相对分子质量。
并非
MS
技术分析的所有样品都需要进
行色谱分析。基质辅助激光解吸离子
化技术（
matrix-
assisted laser desorption/ionization, MALDI
）常用于蛋
白、
多肽、
寡核苷
酸及细菌检测
[16]
。
将待测物与吸
收紫外光
（
ultraviolet,
UV
）
的基质溶剂混合
,
点样于光滑金属板上
,
干燥后放入<
/p>
MS
源
,
一旦达到适宜的
真空状态
,
斑点受脉冲
UV
激光照射会令少量待测物自样品
中释出
,
反应生成
预形成离子或离子
作为分析物进入
MS
分析仪。
TOF
MS
电离呈脉冲性
,
常
用于检测。
MALDI
可用于
MS
成像研究。
另一类已成功运用
于固体样品电离的技术统称为解吸电离
[17]
。该技术通过<
/p>
ESI
或
APCI
电离溶剂后导向固体样品。
电离溶剂与固体反应后令待测物解吸
并离子化
,
随后导入
MS
分析仪。
该技术已可用于干血斑
（
dried blood spot,
DBS
）<
/p>
[18]
分析及
MS
成像。
MS
分析仪联合电感耦合
等离子体（
inductively coupled plasma,
ICP
）炬
管可组成
ICP-MS,
能够检测金属物质。该电离法采用高温（
~ 10 000 K
）
氩气等离子体气流分裂样品并电离。仪器可直接检测样品中的
金属物质
,
有
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