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假基因作为竞争内源性
rna:
目标预测
和验证
摘要：
假基因可以通过各种机制来调
节他们的亲本基因的表达以及其他蛋白质编码基因
。
其中一个调节机制就是可以作为竞争性内源
RNA(ceRNA
)
和参与
microRNA
介导的交叉
调节。
在这里
,
我们描述如何用生物信息学技术来预测
ceRNA
的目标及如何验证实验。
1
Introduction
假基因可以分为三类：假基因分为
三类：未加工假基因，加工假基因和单一假基因，
未加工假基因是通过基因复制而来，保留了内含子和调控序列，
相比之下，
加工假基因来源于反转录转座，
这种假基因缺乏调控序列和内含子，
但含有相当
于它们亲本
的
5
′
and 3
< br>′
UTR
序列元件
unitary
pseudogenes
< br>来源于突变的蛋白质编码基因，但不具备编码功能，所有三种类型的
假基因，即使
被转录成
mRNAye
也最终无法被转录为蛋白质。
重要的是，
加工假基因和未加工假基因跟他们的
亲本基因高度相似，
经常引起一种状况就是：
两种几乎完全相同
的
mRNA
来源于基因组上的不同基因座。
当然，
在多种
mRNA
种类中只有
一
种是来源于亲本基因
,
家基因曾经被
认为是遗传遗迹
,
在过去十年中研究的相对较少。但是，
最近的研究显示：
假基因是在进化中被特意保留下来的，
他们参与了多种监控职能。
假基因
的监控职能是多方
面的，
并且具有亲本基因依赖性或独立性，
它的作用通过假基因
的正义和
反义
mRNA
、
DNA
，甚至是通过由假基因编码的蛋白质和氨基酸来发挥调控作用。
其中一种功能就是最近发现的通过竞争性
内源
RNA
（
ceRNA
）调控基因表达。
ceRNA
具有一个
或多个
mRNA
响应调控元件
(MREs)
，
并参与到对有限的
m
RNA
竞争性的结合中。
比如，
A
、
B
ceRNA
具有相同的
MREs
，
改变
A
ceRNA
的表达，
会改变共有靶
mRNA
的生物使用，
并
且引起
B
ceRNA
表达的改变，<
/p>
A
、
B
ceRNA
会采用相同的变化趋势，这种交谈反过来也可以进行。任何
包含
MREs
的转录都能作为
ceRN
A
，包括长链非编码
RNA
和假基因、
mRAN
。此外每一个转录本可
能包含
许多
MREs
，这大大增加了网络的复杂程度，确保对众多生物
过程的精确调控。异常
的
ceRNA
表
达会导致生物调控网络混乱和疾病的产生。
ceRNA
首先在植物和病毒中被找到，然后我们又在脯乳动物细胞中找到具有
c
eRNA
活性的
mRNA
、
lncRNA
和假基因。特别是我们证明了
PTE
NP1
是一种亲本基因
PTEN
的
ceRNA
，负调控了
PTEN
的表
达，再比如
KRAS1P
负调控了
KRAS
的表达。假基因不仅跟他的亲本基因形成
负调控，同时也跟所有具有
MREs
的转录本形成负调控，
最终形成一个极为复杂的
ceRNA
调控网
络。
在本章我们讲述一下
ceRNA
的
鉴
<
/p>
别和用实验来证明他的方法。这种方法不仅适用于假基因的目标检测，同样适合和任何带有
MREs
的转录
本。
< br>
2 Materials
2.1
组织培养
1
．组织培养制品
2.
合适的细胞系生长介质
3.
磷酸盐缓冲生理盐水
4
．胰蛋白酶
2.2 siRNA
、
DNA
和双重转染
1.
Opti-MEM reduced
血清
2.
siRNAs
重组液
3.
siRNA
转染物
4.
pCDNA3
等哺乳动物表达质粒
5
．
DNA
转染试剂
2.3
RNA
和蛋白质分析
1
．
RNA
提取设备或试剂盒
2. DNAse
3.
cDNA
合成试剂盒
4.
实时
PCR
5.
蛋白裂解缓冲液
6
．免疫印迹分析
2.4
荧光素酶实验
1
．避光
96
孔板
2.
双荧光素酶分析系统
3.
生物发光感光板
3 Methods
3.1
生物信息学预测假基因
ceRNAs
考虑到假基因和
RNA
尚由于多个
MREs
的
存在而引起的放大效应，因此，要选出
具有最好吻合度的假基
因候选者。
这里我们要通过一种计算的方
法，
寻找出给定假基因中最可能的
ceRNA
< br>，
这种计算方法是基
于
MREs
的共有属性的统计学分析。考虑到假基因
A
会产生大量的数据，定义
T
为转录本的
预定义列表，并且按照假基因与靶标之间的相互作用程度来排序，同时定义
M
为
microRNAs
的螯合度列表，
|
M
|
和
|
T
|
将会分别指出
microRNAs
的总数和转录本的总数。
3.1.1
输入
建立一个非负整数矩阵，每一行
的数据来源于转录本列表
T
，每一列的数据来源于
microRNAs
列表
M
，
P
B
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