-
RT-PCR
实验步骤
一、总
RNA
提取
1.
取
200mg
组织，放到
1.5mlEP
管中，加入
1mlTrizol
剪
碎。
2.
震荡
30s
。
3.
加
0.2ml
< br>氯仿，剧烈摇动
30s
，室温
3
min
。
4. 12000
×
g
，
4
℃离心，
15min
。
5.
吸上层无色水相，移入另一
E
P
管中（约
0.5ml
）。
6.
加等体积异丙醇，
-20
℃，
30min
。
7. 12000
×
g
，
4
℃离心，
10min
。在管底部可见微量
RNA
沉
淀
8.
弃上清，加
75%
乙醇
1ml
，振荡。
9. 7500
×
g
，
4
< br>℃离心，
10min
。
10.
弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥
5-10min
。
11.
沉淀溶于
20
μ
lDEPC
水，取
1
μ
l
加入
79
μ
lDEPC
水测
O
D260/OD280
12.
计算浓度与纯度，
-70
℃保存。
<
/p>
二、逆转录合成
cDNA
第一链
反应体系如下
混匀快速离心一次
反应条件如下：
-20
℃冰箱冻存
三、
PCR
反应
混匀快速离心一次
反应条件如下：
< br>PCR
产物
-20
℃冰箱保存<
/p>
取
PCR
产
物
8
μ
l
加
5
×
Loading Buffer
2
μ
l 2%
琼脂糖凝胶电泳
120V
。
100mA 30min
溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
RT-
PCR
实验方法总结
1,2
RT-
PCR
实验有三步：抽提
RNA
，
RT
，
PCR
。<
/p>
要求：
1.
做
RT
前必需测
RNA
浓度，
逆转录体系对
R
NA
量还是有一些要求，
常用
500n
g
或
1ug
。
2. RT
按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR
，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高
，需要有完整的
cDNA
存在，不是单改变
Mg2+
浓度、退火温度能解决的。
< br>1
）
RT
和
PCR
时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须
在
RT
时，
引物设计有
3
种方法即
a<
/p>
：
Random 9mers
；
b
：
Oligo dT-Adaptor Pr
imer
；
和
c
：特异的下游引物。如果用
a
和
b<
/p>
方法，是扩增的所有的
cDNA
（理论上
），
还要用此产物做
PCR
的模板继续扩增。
如果用
c
方法，
那么要去那里查它的序列呢？
问题：
在
做
RT-
PCR
遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从
< br>一种组织中可以扩出我的目的基因，
条带非常的好，
而另
一组织在同样的条件下
却得
到许多非
特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不
得其解！
（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩
增出来）
从这两种组织中提取的
RNA<
/p>
的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会
不会和这有关呢
？
请高手指教！
解答：
-PCR
有两种做法：
条件具备的话可用
kit
进行一步法进行；若条
件不太好的话可分两步进行逆转录
再
PCR
。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我
推测是体系更
加单一比较利于
PCR
的进行，当然也可能是我买的
kit
不太好。
（
pro
mega
）。
-PCR
应具备的条件
高质量的
RNA
（保留后可做
5
‘，
3
’
RACE
）；引物的（最好产物短点）；若
涉及粗略定量的话还应考虑
RNA
的浓度或是
cDNA
的浓度（如果由内标分子更
好，但我发现其实很不容易将
RNA
的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一
样）；体系的均一性
等。
我
< br>做过
RACE
（
3
’
RACE
是宝生物的
Ki
t
；
5
‘
RA
CE
是
Gibico
），但现在再进<
/p>
行另一个同源基因的
3
‘
RACE
时却怎么也
P
不出来
，
这两个基因
是由同一对引
物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（
RACE
< br>的方法），而另一个基因的
3
’
UTR
却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的
3
‘
UTR
太
长的缘故，我都
快绿了，有无
RT-PCR
的常用内标
b
－
actin
和
GAP
DH
的使用有选择性吗？比如不同的细胞，
不同的刺激。
有关内参：
RT-PCR
内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些
），最好分开两管，
把除了引物之外的
mixture
统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是
基因表达的相对浓度
。
问：我曾经作过同一管的
P
CR
，内有
actin
和目的基因引
物。虽然可见到两条均
一条带但图片质量不理想（而且酶量、
M
g2+
加倍）。请教
mxbdna2003
< br>，你是
如何处理同一管的
PCR
的各成分的浓度？
答：
it
should determined the amount of RNA. but it not
for the quantitity of the PCR
. it just
was convienent to guess the amount ot the
template<(for RT and PCR) and bet
trer
for publication and editor if he don not know the
preocedure much. but the amoun
t just
using
of housekeeping gene everytime.
在同一管中做
RT
，其实没有什么问题
，不需要
taq
魅加量，
taq
酶本来就是过量
的
^-^
，（平时做
pcr
的时候，完全可以再省一些
taq
酶的，半斤八两就可以了，
我想这肯定再很多
贴子里应该都谈到了。
Mg
就跟不能变了，一变整个体系就变<
/p>
了。能看到均一条带就很好了。
关
键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上
3
、
5
摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直
到摸的好了，还要考虑比较的
不同的模板中的量，
所以我们不建
议再同一管中进行，
因为还有互相竞争抑制的
问题，即使不同基
因之间。
有关内参的建议：
一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的
电
泳可以不一起跑，没有关系，计算
的是相对表达程度，着我在好几封帖子里
都谈了，再说一边我得观点，
< br>1
、半定量和定量
RT-
PCR
做的都是基因相对表达
量，
<
/p>
不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。
2
、
以电泳为基础的半定量
R
T-PCR
本身是不可信的，
作为实验的粗筛是可以的，
但
不能作为最终结果的，
< br>3
、半定量
RT-PCR
应该再
两管中进行，除非内参基因
和目的基因表达相同，长度差不多，
GC
含量相似，或者实在穷的要省
PCR
管
和
taq
。
关于平台期和线性期的
问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧
2
的冥和
2
的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，
因为牵涉到
酶促动力学的问题，这个我也不
懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学
的东西。我们学医的，也没必要知道那些
，但是其中主要是因为模板引物
酶原
料和
buffer
之间的关系，这种反应单
*
改变其中一种成分没有用的，酶一直是过
量，再加酶也没
用，引物
ntp
都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开
始阶段，
但是要在你的凝胶成像分辨范围内
，
所以选一个这两种的契合点。
给你一张图你
< br>就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在
***
帖过。
关于引物设计，
再可能的情况下，
除了常规要求之外，
最好兼顾
跨内含子
（不过，
根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样
还可以用于基因组
PCR
）、长度
小于
500bp
－
600bp
等等。
引物当然要设计成一样的退火温度，
即使不再一管中，
也要一样的，
要在一
台机
器里啊。
我的引物占了冰箱一格，
大部分是一个温度，
这样任何几个都可以拿来
披，也不用查。<
/p>
我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，
有些基因在它出软件
的时候，
还没发现呢，
跟不要说在基因组的位置和序列了，
怎么考虑内含子的问
题
呢？
18s
的引物也和著名的
β
actin
一样是设计的，只要拿到
序列就可以了，但是限制
是只能用总
RNA
为模板，
但是比
actin
和
bubulin
等可准多了，
更不
要说
GAPDH
这个
破烂了。
18s
除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比
例远远高于看
家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和
eeflying
指教。
我认为，
就像你用某一种东西的数量去概括，
因该选那种多的东西，
< br>说一座房子
是由
2000
块砖造
成的，比说又
29
根梁更准确吧。更不
要说没有看家基因不看
家的缺点，因为他是服务于整个基因组表
达谱什么的。
PE
有专门的用于
实时
PCR
的内参试剂盒，就是用
18
s
，不过我们看懂使用的那
条序列，不知有没有人用过，告知其
序列和
genbank
号。
正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的
actin
的荧
光探针还没有完，当初和成了一堆。
有那位高手用过
18s
的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？
原
位杂交最好用
RNA
做探针，效果好一些，反正你有钱卖
roche
的盒子，而且
量也能保证，
因为转录过程嘛，
沿着一条线突突地跑就是了。
正义反义也容易理
清。
我
觉得做
RT-PCR
的方法和条件及应
注意的事项就是那么几条
,
许多专业书都有
详细的描述
,
但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不
出结果。因此，我认
为
因为每个人所
要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有
他自己的特殊性
,
我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同
,
做不出时还是要
好好动
一下脑子。
记得我开始我的ＲＴ－
PCR
时，按常规方法，提取总
ＲＮＡ后，首先用自己设
计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ
次均没有结果。后来
考虑到本人的克隆的<
/p>
PCR
的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而
该同学已经用
RT-
PCR
克隆出她的片断（尽管她用这些
ＲＴ－ＰＣＲ产物做模
版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物）
< br>，
因此，
我先用她的引物和条件扩
增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改
进，逆转录反应
换用了９
mers
随
机引物），用我的引进物进行一般
PCR
，终于得到我的产物，
测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以
说明实验可以
有自己的模式，
书本的知
识和别人的经验很重要，
但有时也不定要受到书本框框
和别人经
验的限制
请问：
1
引物的特异退火温度怎样设定？可以根据
gc
和
at
含量算出吗？可以用引物报
告单上的
Tm
值吗？
2 PCR
时
20
微升体系中
cDNA
应加多少比较合适？
< br>MgCl2
应加多少？各个成分
的量有无确定标准？
3 PCR
结果跑电泳，
actin
有，但跑不出目的条带，有几种原因？与
cDNA
的量
少有关吗？
Mg
离子太多是否会抑制
Taqase
的活性？
一般来说引物报告单伤得是对的
,
也可以自己算
,
实际上重要的各条引物一致<
/p>
,
剩
下的可以摸的
. 20
中是指体积还是量
?
只要不
明显改变体系的离子强度
,
加
1,2u
l
都可以的
.mg
要调的
,
但我总觉得没有书里讲的那么玄乎
,
我都是常年不变的
.
如果内参照有
,
目的没有
,
至少证明不是
美丽惹
的祸<
/p>
.
原因书里应该都说了
.
在
所有
RN
A
实验中，最关键的因素是分离得到全长的
RNA
。而实验失败的主
要原因是核糖核酸酶（
RNA
酶）的污染。由于
RNA
酶广泛存在而稳定
，一般反
应不
需要辅助因子。
因而
RNA
制剂中只要存在少量的
RNA
酶就会引起
RNA
在
制备与分析过程中的降解，
而所制备的
RNA
的纯度和完整性又可直接影响
RNA
< br>分析
的结果，所以
RNA
的制备与分析操作难度极大。
在实验中，
一方面要严
格控制外源性
RNA
酶的污
染；另一方面要最大限度地抑制内源性的
RNA
酶。
RNA
酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。