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MicroRNAs
与它们的靶点：识别，调
控和一种新
发现的相互作用关系
摘要：
在多种生物途径中，
MicroRNAs
（
MiRNAs
）已被证实是关键的基因调控因子。
这些小的非编码
RNA
结合到
mRNAs
的靶向位点
上，
并且通常是导致基因表达受
到抑制。
目前虽然有几种方法用于鉴定
miRNA
的靶向位点，
但是仅仅确认
miRNA
的结合位点是不足以
预测靶向调控的。
miRNAs
的靶向调控受各个控制水平的限
制，并且最近的研究进展出现了一个新的转折：靶点可以反馈调控
miRNAs
的水
平和作用。
miR
NAs
与靶基因的相互调控作用将激发我们对
miRNAs
在体内所扮
演的基因调控作用的理解，并且这些
RNAs
对于治疗有着重要的意义。
MicroRNAs
(miRNA
s)
证
实
了
一
个
新
的
观
点
：
在
调
控
重
要
性
中
，
非
编
< br>码
RNAs(ncRNAs)
的
作
用
可
能
能<
/p>
与
蛋
白
质
媲
美
。
自
从
最
初
发
现
miRNAs
在
Caeno
rhabditis elegans
线虫发育过程中作为必要的调控因子，
数千种
miRNA
基因
已
经被证实存在于动物和植物基因组中。预计有超过一半的人类转录组是受
miRNA
调控的，
几乎每一个串联基因都嵌入了这种转录后调控途径。
鉴于这种具
有深远意义的作用，
miRNA<
/p>
的破坏作用有助于包括癌症、
心脏疾病和神经系统功
能紊乱等人类疾病是不足为奇的。此外，
miRNAs
将发展成为靶向和疗法，进而
实现产业化，
以希望通过驾驭这
种
RNA
引导的基因调控力量去对抗疾病和感染。
miRNAs
以
21~2
4
个核苷酸发挥作用，
它们调节含有互补序列的
mRNA
的基因
表达。图
1<
/p>
显示了一般的
miRNA
的生物合成途径
，并且这个典型的途径在其他
地方也得到了全面的检验。最后，成熟的
< br>miRNA
结合
AGO
蛋白形成
一个
miRNA
诱导沉默复合体
(mi
RISC)
。在动物中，
miRNA
与
mRNA
位点的部分互补可以通过
包括
mRNA
降解和翻译抑制等一系列机制导致蛋白表达的减少。<
/p>
最初，
在植物中
miRNA
的功能非常明显，
它们可以与靶基因完全碱基互补，
进而导致靶基因的分
裂和降解。
然而，
最近的研究显示植物可以通过翻译抑制途径沉默靶基因，
并且
还
有待确定到底有多少植物
mRNA
通过与
miRNAs
部分互补进而受到调控。
此外，
在所有有机体中，如果有催化活性的
AGO
蛋白结合，
miRNA
与靶向位点的完全
互补可以
导致靶基因降解。
本综述重点在于确定内源性
miRNA
靶基因的复杂性和它们是如何调控的。
新<
/p>
近发展的全基因组方法，比如紫外下的
交联免疫沉淀反应
(CLIP)
，对于确定内源
性的
miRNA
结合位点有着推进作用。此外，像核糖体分析等技术都可以用于解
析受
miRNA
作用的基因调控途径。
这些前沿的方法已经揭示了
miRNA
靶向全基
因尺度的新特征，并且还为进一步探索体内
miRNA
对靶基因的识别和调控的规
律提供了丰富的数据。然而，预测内源体内一个
mRNA
是否受
miRNA
调控却是
另一个挑战，因为目前已经有许多例子显示有许多因子能调控
< br>miRISC
去结合并
抑制特殊的靶基因。
miRNA
和靶基因调
控的新发现的相互作用性质又使其复杂性
增加，这种关系也必须在
miRNA
靶向作用关系全面解决之前得到理解。
注
：
miRNA
诱导沉
默复合体
(miRNA-induced silencing complex, m
iRISC):
它由
miRNA
引导体
和效应蛋白组成，其中至少包括
Argonaute
蛋白（
AGO
蛋白）
。这
个复合体募集其他蛋白来
调控靶向
mRNAs
< br>的平衡和翻译。
交联免疫沉淀反应
(Crosslinking
immunoprecipitation
,
CLIP):
是一种分离和鉴定由特殊的
RNA
结合蛋白所结合的序列的方法。
miRNA
复合体蛋白（如
AGO
蛋白）的交联免疫沉淀已
经被用于检测全基因组水平上的
miRNA
诱导沉默复
合体的结合位点。
图
1
mi
RNA
的
生
物
合
成
。
在
动<
/p>
物
体
内
，
microRNA(miRNA)
基
因
转
录
为
初
级
miRNA(pri-miRNA)
转录本，通
过
Drosha
酶复合体作用形成具有发夹结构的
miRNA
前体
(pre-
miRNAs)
。
pre-miRNA
然后由转运蛋白
5(XPO5)
转移到细胞质中。
Dicer
酶复合体将
pre-miRNA
的环状结构切除，形成的双链体的一条链被
AGO
蛋白结合形成
miRNA
诱导沉默
复
合体
(miRISC)
，
miRISC
靶向调控
mRNA
。常被称作星链
(miRNA*)
的另一条链被降解。在植
物中，除了
Dicer
样蛋白
(DCL
)
在细胞核中完成切除阶段和通过结合
AGO
< br>蛋白形成成熟的
miRNA
并转移到细胞质中，其他过程
也基本相似。
在本综述中，
miRNA
的靶向位点
和内源靶基因的鉴定将被首先讨论。
接下来，
通过几种精确定位
靶基因的方法阐明靶向调控机制。最后探讨新提出的
miRNA
和靶基因的相互作用关系，
miRNA
的调控作用也将包含其中
。
miRNA
靶向位点
在
miRNA
领域，
miRN
A
如何识别部分互补的特殊序列是一个突出的问题，
这
也使得靶位点的预测更加复杂化。鉴于匹配
miRNA
< br>和特殊靶序列的挑战，已经
有几种方法被用于鉴定它们的相互作用。
miRNA
靶向位点的特征。
miRNA
的小尺寸提供了数量有限的特异性序列信息。
此
外，因为
miRNA
和靶位点的部分结合常常是充分的，所以一
个广泛的基因网
络可能受到调控。这种特性不仅意味着单个
mi
RNA
可以调控多个
mRNA
，也说<
/p>
明了预测这些靶点不是简单的直接关系。在植物中，基因的外显子和
3
′
非翻译
区
(UTRs)
都是靶位点，并且调节的效率与靶位点的位置
没有相关性。植物
miRNA
可能既能和靶基因形成近乎完美的
双链结构，
进而使
mRNA
通过内切核
苷酸裂解
(
图
2a)
< br>；
也能通过不涉及裂解的途径调节靶基因，
但不包括严格
互补配对的情况。
裂解产物可以被克隆和鉴定，进而可以证实直接的
miRNA
靶向关系。这已是一
个有成效的用于发现植物中
真正的
miRNA
靶位点的方法。缺少大量
miRNA
配对
能力的靶基因将不会受到裂解，这种靶基因
在植物中正在被探寻。
在动物中，大多数
miRNA
只能与靶基因形成
部分互补的双链体，并且到目前
为止的研究中发现大多数靶
mR
NA
是通过
3
’
UTR
作用受到调控的。
miRN
A
和靶
位点近乎完美的互补进而导致
m
RNA
裂解仅有极个别的例子，比如
miR-196
和
HOXB8 mRNA
的一个序列。然而，大多
数情况，涉及的是不匹配和大多数核苷酸
凸起的双链体。最常见的作用元件在
miRNA5
’
末端完
全配对的
2-7
个核苷酸，
这被叫做“
种子”区
(
图
2b)
< br>。在不少实验研究中发现，种子配对是
miRNA
途径<
/p>
调控的充分必要条件。
miRNA5
’<
/p>
末端与靶基因的不完全配对有时可以得到
3
’
末
端
大量配对的补偿，这可以从致死因子
7(let-7)miRNA
靶位点在线虫的非正常细
胞系
41
（
lin-41
）得到印证（图
2c
）
。最近的研究发现，
“中心位点”已经被
描述，
miRNA
的中间区域可以与靶序列连续碱基配对（图<
/p>
2d
）
。也有许多例子与这个描
述不一样的
（图
2e
）
。
动物体内中
miRNA
这种明显的靶向作用灵活性暗示了作用
因素不仅仅只是配对调控。
图
2
mi
RNA
靶向识别位点的例子
。
miRN
A
不同程度的碱基配对介导的靶向识别。
a
：
在植物中，
miRNA
往往与靶
位点几乎完全配对。
例如，
在拟南芥中，
miR-171
（
也被称为
miR-
39
）
通过在编码区与一个位点完全互补调控稻草人样
6III
（
SCL6-III
< br>）
mRNA
。
b
：
在动物中，
miRNA
与靶
位点部分配对是比较典型的。一般
miRNA
只有
2-7
个碱基与靶基因完全配对，这个区
域叫种子区
，是一个常见的作用元件。在线虫中，
lin-4miRNA
可
以识别非正常细胞系
14
（
lin-1
4
）
mRNA
的
3
’
非翻译区
（
UTR
）
的一个位点。
Lin-14 3
’
UTR
< br>下面的线条表示其他
lin-4
靶向位点，不是所有都是
种子配对。
c
：有时，种子区完全配对的缺失会受到
miRNA 3
’
末端
大量配对的补偿，线虫中的
lin-41
3
’
UTR
的一个位点与致死因子<
/p>
7
（
let-7
）
miRNA
配对可以
印证。
一个额外的
let-7
靶位点正好在下游可以形
成双链体。
d
：
miRNA
种间序列与靶位点的
配对也可以介导基因调控，比如人类
< br>Raptor
基因与
miR-124
。
e
：动物
mRNA
通过编码区受
调控的也有记录，在这些情况下，靶位点跨越外显子连接点，例
如老鼠中
Oct4
（也被叫作
Pou5
f1
）与
miR-470
配对。
鉴定靶基因与
miRNA
的结合位点的方法。鉴定
miRNA
的靶基因和调控的序
列的复
杂问题已经被多元互补法解决（框
1
）
。第一个被发现的
miRNA
靶基因是
miRNA
功能缺失型的基因抑制子（框
1
< br>a
）
。基于
miRNA
通过碱基配对作用调控
mRNA
的早期证据，许
多电子计算方法也相继发展来预测
miRNA
靶位点。某些
特征，
比如在非结构化的
AU
丰富区的保守的种子配对，
已经形成潜在
miRNA
靶
位点的知识点
（框
< br>2b
）
。
尽管如此，
大多数算法对于部分互补
miRNA
靶位点的预<
/p>
测都有显著差异，假阳性和假阴性难以区分。
< br>计算机预测功能的
miRNA
靶位点的诸多挑战之一是受
限于
miRNA
靶相作用
中的内源性方
面的验证。
通常情况下，
通过融合序列的靶标预测包含在存在或
缺
乏同源
miRNA
时靶点的报告基因
和调控分析。在这里，正常的调控环境——包
含
mRNA
水平和细胞水平已经丢失。但是，现在可以通过
miRISC
的免疫共沉淀
测序鉴定内源性靶位点，免疫共沉淀可以通过利用高通量测
序技术
CLIP
(CLIP
–
seq
，或者
HITS-CLIP)
实现（框
1c
）
。这
些研究提供了大量数据支持
miRNA
靶位
点的种子配对、保守性和结构性共同特点。尽管如此，他们还指出新的因素，如
比原
先认为的更大的
miRISC
与编码外显子的作用，以及存在着
许多其他的的结
合位点。
CLIP
的一
个局限是不能利用其他实验鉴定结合位点的功能。比较
CLIP
结果的数据直接分析
mRNA
或蛋白水平的改变，还需要判断是
否
miRISC
与靶基
因的结合会抑制
表达。
这可以由全基因组水平上通过转录组芯片分析技术或
RN
A
测序技术（
RNA-seq
）和蛋白
定量得以实现，比如在细胞培养中利用同位素标记
氨基酸（
SI
LAC
）
。
miRNA
的靶向调控
用来调节通过
miRNA
的靶基因的表达机制一直是
一个有争议的问题，
因为那
里是靶
mR
NA
不稳定，平移镇压，甚至激活基因表达的证据。在植物和动物中，
< br>miRNA
能够通过
RNA
降解
的目标，
以及翻译抑制通路沉默。
其目标网站的
miRNA
的完美配对支持
endonucleoly
tic
AGO
蛋白（图
3a
）的
mRNA
裂解。这是一个共
同的机制，但植物是罕见的动物。尽管如此，通过其他机制的靶
mRNA
不稳定，
是在动物的
miRNA
调控的共同结果。
miRISC
< br>，其中包括
GW182
蛋白，
3
'UTR
靶
序列的结合可以导致在招聘腺苷因素删除的
poly
（
A
）
尾巴的
mRNA
容易降解
（图
3b
）
。也有植物和动物的<
/p>
miRNA
导致减少蛋白质（但不表达）的水平，这表明平
移镇压
miRISC
执导的案件。阻止蛋白质
的生产是不清晰，有实际的机制是抑制
翻译起始或伸长率，以及定向正在从目标
mRNA
（图
3c
，<
/p>
d
）合成肽的蛋白质的
证据。最近的工作
表明，由
GW182
招募，靶
mRNA
的
CCR4
，并不复杂，也可来
抑制翻译起始
（图
3c
）
。
为了使问题更复杂，
在某些情况
下的
miRNA
目标
transla<
/p>
的刺激也有报道。例如，的
miR-16
的目标为
myt1
激酶的
mRNA
与
Argonaute
蛋
< br>白和脆性
X
智力的迟缓蛋白
1<
/p>
（
frx1
）
，
激活其在爪
laevisoocytes
表达（图
3e
）
。
总体而言，通常的
miRNA
抑制基因表达，并积极调控目标是否超出延长有限的
情况下，迄今已发现，仍有待观察。
图
3
mi
RNA
的靶向调控机制
。
microR
NA
（
miRNA
）通过多种途径调控
基因
的表达。
一系列的真核细胞起始因子
（
eIFs
）
结合
< br>5'
帽子区和细胞质的
poly
（
A
）
结合蛋白（
< br>PABPC
）
，连接
mRNA<
/p>
的
5'
和
3'
末端并通过核糖体（粉红色）刺激
它们的翻译。
a
| miRNA
和其靶
位点之间的完美配对诱导
Argonaute
蛋白
（
AGO
）
的核苷酸内切酶
酶切，
导致
mRNA
的快速降解。
b
|
miRNA
复合体与靶基因
3'
非<
/p>
翻译区（
UTR
）位点的部分配对可以导
致
mRNA
的脱腺苷化，这个过程是通过
miRNA
诱导沉默复合物（
miRISC
< br>）相关联的
GW182
蛋白募集
CCR4-NOT
复合体
得以实现的。
poly
（
A
）
尾巴的缺失会导致
PABPC
分离并诱导
mRNA
的降解。
c
|
miRISC
也能通过
GW182
对
CCR
4-NOT
复合体的募集阻断翻译起始进而导致翻译
抑制。
d
|miRISC
也可以在翻译起始之后的某一步诱导翻译抑制，比如促进核糖
体脱离或刺激新生肽的蛋
白质水解。
e
|
< br>在一定条件下，
通过一种涉及
AGO
蛋白
和脆性
X
记忆迟滞蛋白
1
（
FMR1
）的机
制，
miRNA
被证明也能上调靶基因的表
达。
框
2
对鉴别靶向调控的不同机制的方法进行了总结。简言之，
方法有传统的
集中化验
mRNA
水平。
然而，它也是重要的调查的
poly
（
A
）尾巴的长度，以确
定案件中腺苷诱导的
miRNA
，但靶
mRNA
不退化
。的首次大规模尝试分析蛋白
表达或协会与核糖体转录
miRN
A
的依赖性变化表明，在很大程度上与
mRNA
不
稳定的相关法规。核糖体分析的最新发展（框
2b<
/p>
）提供了一个敏感的方法研究
与翻译抑制
RNA
的降解作用。在培养的哺乳动物细胞的核糖体分析，增加了进
一步的证据，由
miRNA
的调控主要是通过基因不稳定，
反对翻译抑制。这是否
是在其他细
胞的背景或
mRNA
的降解或翻译抑制是否是一个原因还有待证
明。
框
1
鉴定
miRNA
靶点的方法
多年以来，许多方法已被用于
miRNA
的靶基因检测，涉及范围从小尺度
的遗传学研究到计算机预测和高通量生物化学方法
。
遗传学方法
<
/p>
这种方法识别
miRNA
靶基因通过表型
的抑制试验。通常情况下，先筛选候选基因，
获得一个
miRN
A
的功能缺失型。例如，致死因子
7
（
let-7
）突变体线虫，发现异常细胞
突变细胞系
41
（
lin-41
）
，表明
lin-41
是我们的目标，
let-7
的
mi
RNA
（如图
a
）
。
miRNA
的
突变株，受到传统
的诱变或
RNAi
抑制筛选。靶基因的
miRNA
突变的背景下，通常上调。
靶向调控的效率
在内源环境下，
许多因素都能影响
miRNA
复合体结合并
调控特定靶基因的能
力。
靶位点的环境
与
miRNA
提供的有限序列特异性，其他因素肯定会影响体内的靶向定位。已
与目标站点内的
mRNA
的位置以及它是如何
识别和
miRISC
调控。一个的
3'
UTRs
疗效与目标相关的功能，是目标网站的位置。
AU
丰富区和一般非结构化
框
2
研究
miRNA
靶向调控的方法
。
RNA
表达分析
由于
microRNA
（
miRNA
）
经常促进靶
mRNA
不稳定，
降低
mRNA
水平可能直接
miRNA
调控的结果。
Northern
杂交或定量
PCR
可以用来分析特定的基因。全基因组研究，用
来比较的存在和缺乏具体的
miRNA
微阵列和
RNA
测序的
mRNA
丰度的变化。腺苷往往
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