-
miRNA
常用实验方法；一、
miRNA
的检测方法；
miRNA
的
realtime-PCR
检测
方法；
1
、
realtime-
PCR
引物设计；
miRNArealtime-PCR
引物设计方法：
；
1
）
stem-loopRT
引物设计：基于通用的茎；
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG
；
2
）
realtime
上游引
物设计：
miRNA
序列；
3
）下游引物是通用的，序列
miRNA
常用实验
方法
一、
miRNA
的检测方法
miRNA
的
realtime-
PCR
检测方法
1
、
realtime-PCR
引物设计
miRNA realtime-
PCR
引物设计方法：
1
）
stem-loop RT
引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的
miRNA
序
列
修
改
最
末
端
6
个
碱
基
即
可
。
通
用
茎
环
结
构
序<
/p>
列
为
：
GTCG
TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC
例
如
设
计
miR-1
（
UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU
）的
RT
引物，只需在通用茎环序
列后架上
miRN
A3’
< br>末端的
6
个碱基的反向互补序列，即
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG
GATACGACATACAT
2
）
realtime
上游引物设计：
miRNA
序列除去
3’
端
6
个碱基的剩余部分作
为上游
引物，
如
miR-1
的上游引物为
(
注意把
U
改为
T)
：
T
GGAATGTAAAGAAGT.
检查
引物的
Tm
值（一般参考
DNAMAN
）
，如果
Tm
值较低，则在
5’
端加
GC
使
Tm
值接近
60
度。
因此
miR-1
的上游引物可设计为：
GCGCTGGAATGTAAAGAAGT
，
61.4
度。
3
）下游引物是通用的，序列为
GTGCAGGGTCCGAGGT
。
4
）引物设计好后
，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来
检测引物的特异性；同时最
好将
PCR
产物进行电泳检测产物是否单一（因产物
长度很小，需要
3%
以上的琼脂糖胶）
。
2
、
miRNA
反转录
< br>miRNA
的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。因为其产物很短，用最普
通的逆转录酶即可。我们一般使用的是
TIANGEN
的
MLV
，逆转录体系为：
RNA 500ng~2ug
5xbuffer
2ul
dNTP 0.25ul
DDT 0.25ul
RRI 0.25ul
MLV 0.25ul
RT primer 0.5ul
H2O(RNase
free)
补至
10ul
程序为（
PCR
仪中通常命名为
CTFRT
）
16
度，
30m
in
；
42
度，
60min
；
85
度，
5min
；
4
度，
hold
。
！
！做
miRNA
的反转录时，注意不要忘记内
参的
RT
，即一
个样品至少要做目的<
/p>
miRNA
和内参两管反转录反应。
3
、
realtime-PCR
实验
miRNA
逆转录完成后得到的
cDNA<
/p>
即可进行下一步
PCR
。在确认引物的特
异性
后，我们可以进行正式实验。一般每个样品至少需要
3
个平行孔。
Realtime PCR
体系
为（
ABI
定量
PCR
仪
需要加
ROX
dye
II
，
Biorad
定量
PCR
仪不需要加
ROX
）
：<
/p>
2X SYBR 10 ul
ROX
II 0.4ul
（
Biorad
不加）
Primer 1ul
Template 1ul
H2O 7.6ul
（
Biorad
8ul
）
需要注意的几点：
1
）在配制
PCR
体系
时，请一定配制总体系，逐步分装。每步
分装前充分混匀。这一点是
PCR
平行性的保证。
2
）配制体
系尽量在冰上进行。
3
）请选用比较准确的枪进行体系配制，并
注意体系的冗余。一般来说，配制一
整个
96
< br>孔板的
PCR
体系，
我会配制<
/p>
100
个反应的总量，
保证分装到最后稍
有剩
余。
PCR
< br>程序：
95
度，
1min
；
95
度，
5s
；
60
度，
34s
（此步在读取荧光值）
。
40
到
45
个循环。
4
、
realtime
PCR
结果分析
realtime
PCR
反应结束后返回
Ct
值，可以利
用定量
PCR
仪软件自带的程序进行
分
析，也可以利用
EXCEL
表格进行相对定量计算。具体的计算
方法：将三个平
行孔的数值拷入到
EXCEL
< br>表格的相应位置，即可自动计算出相对值。注意，第
一组样品的值将被默认为归一
为
1
。其他的样品与之相比得出相对值。
EXCEL
表格公式见附件。
二、
miRNA
靶基因的预测
miRNA
靶基因预测软件简介
1
、
TargetScan
：
/
首先选择预测的物种，如果要预测小鼠的
miRNA
和靶基因，则点击右上角的
“
Go to
TargetScanMouse”
。第二个选项可输入基因名（有时不识别别名）
，点击
submit
即可，
此操作可预测可能靶向该靶基因的
miRNA
；
或者输入
miRNA
的名字，
点
击
submit
，此操作可以预测该
miRNA
的靶基因。
2
、
Pictar
：
/
< br>输入网址后进入
pictar
主页，下面有几个可选用的
数据库，一般选用最后两个数
据库即可。点击进入预测界面。选择物种，选择要预测的<
/p>
miRNA(
注意：如果你
感兴趣的
miRNA
在下拉菜单中未列出，
则不可预
测，
可考虑换用其他软件
)
并点
击
search for targets of a
miRNA
或输入
gene ID
（注
意：与
targetscan
不同，
p
ictar
一般不识别基因名，最好输入
gene
号：
NM_*****
）点击
search for all miRNAs
predicted to
target a gene.
进行预测。
3
、
Mirbase
：
/enright-
srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/
分别输入<
/p>
miRNA
名或基因名即可进行预测。其他选项不用更改。
预测结果的处理和分析
< br>我们通常会将三种不同软件的分析结果做比较，
选取两种以上软件预测的交集部<
/p>
分作为我们候选的靶基因。
如果这样的结果仍然过多，
可以选取三种软件预测的
交集进行下一步筛选。
如
果三种软件预测的结果没有交集部分，
可以取并集，
然
后从中按功能提示进行挑选。
三、
miRNA
的过表达和敲低
1
、
过表达
过表达
miRNA
一般可采用两种方法：
a
构建过表达载体；
b
人工合成成熟<
/p>
miRNA
。
a
构建过表达载体
1
）
获
取
miRNA
基
因
的
序
列
及
旁
侧
序
列
进
入
Ensembl(/)
主页。
输入
miRNA
名，点击进入。在
export
data
页面上选择输入
5’flanking
sequence
和
3’flanking
sequence
分别为
200bp
(
见下图
)
，然后点击
next
即可得到包括前体
和左右侧翼
200bp
的序列。
2
）基于这段序列，我们可以设计该
miRNA
的表达序列。引物设计原则：扩增
产物包括前体，
并左右各有
至少
70bp
的侧翼序列，
长度一般在
200bp-500bp
。
其
他同一般引物设计。载体可以选用任意使用
RNA polII
识别的启动子的载体，包
括
T7
，
CMV
等。常用的是
pcD
NA3.1
，不要带标签的。注意：如果
miRNA
位
于
cluster
中，
则扩增长度要控制，避免同时包括两个或两个以上的
miRNA
。完
成表达载体的克隆并测序确认后，
转入到细胞中进行表达检
测。
如果目的
miRNA
的表达明确，
则载体构建完成。
b
合成成熟的
miRNA
序列查出
miRNA
的准确序；
2
、敲低；目前做内源性
mi
RNA
的敲低一般使用人工合成的
m
；
报告基因实验方法；
一
、
miRNA
靶基因筛选；
荧光素酶报
告基因实验；
1
、荧光素酶报告基因质粒的构建；载体质粒为经
过改
造的
pcDNA3.1
，其图谱见
下；
NotI.
；
XhoI
；
XbaI
；靶基因
3’
UTR
的获得；
2
、
< br>荧光素酶实验；构建好荧光素酶报告基因实验后
b <
/p>
合成成熟的
miRNA
序列
查出
miRNA
的准确序
列，
请公司合成成熟的序列。
常用的公司有：上海吉凯；
invitrogen
等。
2
、
敲低
目前做内源性
< br>miRNA
的敲低一般使用人工合成的
miRNA
的反义链，
即成熟
m
iRNA
的序列的反义互补序列。如
mir-x
序列为
UCACACAACCCACCACCAUUG
，则其
inhibitor
序列为
CAAUGGUGGUGGGUUGUGUGA.
将该序列送交公司合成即可。
报告基因实验方法
一、
miRNA
靶基因筛选
荧光素酶报告基因实验
1
、荧光素酶报告基因质粒的构建
<
/p>
载体质粒为经过改造的
pcDNA3.1
，
其图谱见下图。
可用的酶切位点为
N
otI
，
XhoI
及
< br>XbaI.
推荐优先使用
XhoI
和
XbaI
两个酶切位点。如过不能用，可用
NotI.
XhoI
XbaI
靶基因
3’UTR
的获得。3’UTR
序列是指从
Mrnaz
终止密码子后的第一个碱
基开始到
mRNA
最后一个碱基（通常是
polyA
结尾
）。模板可采用相应物种的
cD
NA
或
基因组。在选择模板时要注意：一般来讲，
cDNA
适于所有的
3’UTR
扩增，
但有时
3’端
AT
过多导致引物设计困难时，可以考虑用基
因组做模板。但是基
因组做模板的前提是靶基因
3’UTR
由一个外显子组成。相关信息可以从
ensemb
< br>l
中查阅外显子信息可以知道。一般尽可能全面的扩增
3
’UTR，但如果
3’UTR
过长或引物设计困难，可以选取包
括
miRNA
结合位点的一段
3’UT
R。引物设计
的原则同一般引物设计。
2
、荧光素酶实验
< br>构建好荧光素酶报告基因实验后，
准备开始做报告基因实验前，
< br>你还需要准
备以下材料：
1
）<
/p>
TK
质粒，作为共转染的内参。
2
）
miRNA
的过表达质粒或合成的
miRNA
。质粒的浓度尽量在
500ng/u
l
以上，合成的
miRNA
稀释到
20uM
。
3
）状
态
良好的细胞。
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