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(dT) capture
因为
Oligo(
dT)
与
mRNA
的
< br>Poly(A)
尾巴可以发生特异性结合，
所以用
Oligo(dT)
特异结
合到
mRNA
上
Poly(A)
尾端，
以此可以特异地将
mRNA
从总
RNA
中分离出来。
属于亲和层
析技术。
2.
反转录（
RT-
PCR
）
因绝大多数
真核细胞
mRNA 3
’
端具有
Poly(A)
< br>尾，
Oligo(dT)
与其配对，仅
< br>mRNA
可被
反转录
。由于
Poly(A)
RNA
仅占总
RNA
的
1-4%
，故此
种
引物合成
的
cDNA
比随机六聚体
作为引物所得到的
cDNA
在数量和复杂性方面均要小。但是在
反转录
从
mRNA
获得
cDNA
时，也可以用随机六聚体引物和
特异性
引物。
随机六聚体
引物
：当特定<
/p>
mRNA
由于含有使
反转录酶
终止的序列而难于拷贝其全长序
列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的
引物来拷贝全长
mRNA
。用此种方法时，体系
中所有
RNA
分子全部充当了
cDNA
第一链模板，
PCR
引物在扩
增过程中赋予所需要的
特
异性
。通常用
此
引物合成
的
cDNA
中
96%
来源于
rRNA
。
特异性
引物<
/p>
：最特异的引发方法是用含目标
RNA
的
互补序列
的寡核苷酸作为引物，若
PC
R
反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与
mRNA 3
’
端最靠近的配对引物起始。
用此类引
物仅产生所需要的
cDNA
，导致更为特异的
< br>PCR
扩增。
使用
oligo
dT
引物扩增的产物
,
可以保证扩增
产物包括
mRNA
的
3'
末端
(
减少
rRNA
的干扰
),
但是
oligo
dT
primer
扩增有一个问题
,
就是扩增片段的长度和扩增产物所包含的信息量的
问题
,
之所以有长度这个问题
,
一方面和
lz
所提到的
RNA
完整性有关
,
但最重要的限制在于逆
转录酶的延伸能力
.
用
oligo
dT
primer
扩增可能出现扩增出来的片段长度短
,
虽然都有
mRNA
的
< br>3'
端
,
但是序列信息多位于
3'-UTR
附近
,
若扩增序列太短
,
则有用信息很少
,
不利
于序列的识别和分析
.
使用
random primer
,
也有片段长度的限制
,
但是由于它的
逆转录并不一定在
mRNA
的末端
起始
,
而是在随机位置起始
,
所以它的扩增片段带有更多
CDS
的信息
.
但是如果是用总
RNA
逆转录的话
,
有可能会受到
rRNA
的干扰
.
至于
Gsp,
只是在扩增已知
gene/gene family
以及部分原理的
RACE
中使用
.
用随机引物时
要去除总
RNA
中的
< br>tRNA rRNA,
只保留
mRNA
如果接下来你的
PCR
产物是外显子，就用
oligo dT;
如果是内含子或者包括部分内含子，就用
random
mRNA
反转录之后的
cDNA
为模板进行
PCR
，
不都是外显子吗？内含子在这之前都被剪切掉
了。所以不知道
“
内含子
...”
这句话是什么意思，或者有其他的含义，求解！
如果你想要做蛋白表达，就用
Oligo
dT
，要是你做的基因包括内含子就用随机引物喽。
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