-
烟萆脉带花叶病毒非翻译区顺式作用元件的解析及马铃薯
X
病
毒超表达及沉默载体的构建
复制在病毒的整个生命循环中非常关键。
病毒的复制受基因组中顺式作用元
件的调控
,
而这些元件多数位于基因组末端的<
/p>
5
′
-
和
3
′
-
非翻译区
(untranslated
region,UTR)
内
,
因此研究病毒的
UT
R
与侵染的关系对解析其中顺
式作用元件、理解病毒复制过程十
分重要。
本研究以烟草脉带花叶病毒
(Tobacco vein
banding mosaic virus,TVBMV)
侵染性克隆为研究材料
,
通过缺失基因组
5
′
-UTR
和
3
′
-UTR
的不同序列
,
明确影
响病毒侵染的顺式作用元件。
植物病毒侵
染性克隆不单是研究病毒侵染的有力工
具
,
它也可以改造为超表达载体
,
用来生产具有商业价值的功能
蛋白
;
以及病毒介
导的基因沉默载体<
/p>
(virus
induced
gene
silencing,VIGS),
用来研究植物内源基
因的功能。
本研究以
PVX1985
分离物构建了能通过农杆菌浸润的
侵染性克隆
pCaPVX100,
并改造为超表达载体
pCaPVX440
及
pCaPVX760,V
IGS
载体
pCaPVX440-LIC
。主要
研究结果如下
:(1)
从
TVBMV
5
′
-UTR(171
nt)
的
5
′
-
端依次缺失
7
、
25
、
64
、
150
和
171
nt
,
获得缺失突变体
5
′
-
Δ
1-7
、
5
′
-
Δ
1-25
、
5
′
< br>-
Δ
1-64
、
5
′
-
Δ
1-150
和
5
′
-
Δ
1-171
。
通过农杆菌浸润将上述突变体分别接种本氏烟
,
以接种野生型
pCaTVBMV-GFP(wt)
的植株为对照。
结果发现突变体
5
< br>′
-
Δ
1-7
< br>、
5
′
-
Δ
1-25
、
5
′
-
Δ
1-64
< br>、
5
′
-
Δ
1-150
能够系统侵染本氏烟
,
但随着缺失区域的扩大
,
系统侵染
所需要的时间越长
,
病毒
< br>RNA
的积累量越低
,
而突变体
5
′
-
Δ
1-171
不能系统侵染
本氏烟。
除突变体
5
′
-
Δ
1-7
的部分子
代
RNA
回复为
wt
< br>外
,5
′
-
Δ
1-25
、
5
< br>′
-
Δ
1-64
、
5
′
-
Δ
1-150
的子代
RNA
没有回复为
wt
序列
,
但在其基因组的
5
′
-
端都添加了富
含
AU
的序列。即使是同一突变体的子代
RNA,5
′
-
端所加
AU
的数量及顺序都不
相同
,
然而所有突
变体的子代
RNA
在
5
′
-
末端都具有类似
wt
的
A4-6U
序列。
为了明确各子代病毒基因组
5
′<
/p>
-
端富含
AU
的
序列是否还会继续变化
,
我们
将
5
′
-
Δ
1-64
、
5
′
-
Δ
1-150
系统侵
染的叶片分别通过摩擦接种本氏烟进行传代
,
发现第
5
代病毒
RNA
的序列与
第
1
代的序列不同
,
< br>并出现了主导序列。将这两种
主导序列分别添加到
5
′
-
Δ
1-64<
/p>
、
5
′
-
Δ
1-150
基因组的
5
′
-
末端获得衍生物
5
′
-
Δ
< br>1-64-5
、
5
′
-
Δ
1-150-5,
发
现其比原始突变体发病所需时间缩短
,
说明主导序
列的插入有利于病毒的侵染。
带有
5
′
-
Δ
1-25
、
5
′
< br>-
Δ
1-64
、
5
′
-
Δ
1-150
的农杆菌混合后浸润本氏烟
,
< br>子代
RNA
的序列全是
5
′
-
Δ
1-25
的子代
RNA
序列
,
说明缺失碱基数少的突变体子
代
RN
A
在侵染的过程中具有优势。将
tvbmv5
< br>′
-utr
的
26-171nt
进行分段缺失
,
获得缺失突变体
5
′
-
Δ
26-64
、
5
′
-
Δ
65-100
、
5
′
-
Δ
101-125
、
5
′
-
Δ
126-150
、
5
′
-
< br>Δ
151-160
及
5
′
-
Δ
161-171
。
接种结果表明
,
突变体
5
′
-
Δ
65-100
、
5
′
-
Δ
< br>101-125
、
5
′
-
Δ
126-150
的
系
统发病时间及病毒
rna
的积累和野
生型病毒一致。
5
′
-
Δ
26-64
侵染的植株荧光
亮度低
,rna
积累少而
5
′
-
Δ
151-160<
/p>
侵染的植株荧光亮度及病毒的
rna
积累
量
比
wt
的高。
测序发现上述各突变体的子代
rna
与父代的基因组完全一致。将带有
5
′
-
Δ
161-171
的农杆菌接种本
氏烟
,
发现植株的系统发病时间比
wt
的要长
,
其子代
rna
在父代缺失位点的序列相当多样。
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