-
埃尔曼的试剂
，
5,
5'
二硫代
双
-
（二硝基苯甲酸），
5
克
分子量：
396.35
CAS
号：
69-78-3
使用半胱氨酸标准精确量化巯基程序
材料的制备
1
反应缓冲液：
0.1M
的磷酸钠，
pH
8.0
，含有
1
mM
的
EDTA
半胱氨酸标准品，分子量
136.2
：配成一定浓度梯度
3 Ellman
试剂溶液：
1mL<
/p>
反应缓冲液
4
毫克溶解
< br>DTNB
程序
1
用反应缓冲液配制一定浓度的半胱氨酸工作液
Standard
A
B
C
D
E
F
G
Volume of Reaction
Buffer
100 ml
5 ml
10 ml
15 ml
20 ml
25 ml
30 ml
Amount of
Cysteine
(M.W. = 136.2)
20.43 mg
25 ml of Standard A
20 ml of Standard A
15 ml of Standard A
10 ml of Standard A
5 ml of Standard A
0 ml
1.5 mM
1.25 mM
1.0 mM
0.75 mM
0.5 mM
0.25 mM
0.0 mM (Blank)
Final Concentration
2
取若干试管，每管含
50
μL
Ellman
试
剂和
2.5mL
的反应缓冲液。
3
在各试管中加入
< br>250μL
各浓度的标准工作液或待测物溶液
注
：
对于未知的样品需要稀释，
以便使其浓度标准曲线的工作范围之内
（理想的
浓度为
0.1-1.0
）。
4
在室温混合和反应
15
分钟。
在
412
nm
处测量吸光度。
根据得到数值生成一个标准曲线，测定待测样品由标准曲线计算
SH
含量
摩尔吸光系数的程序精确量化的巯基的
材料的制备
1
反应缓冲液：
< br>0.1M
的磷酸钠，
pH
8.0
，含有
1
mM
的
EDTA
< br>Ellman
试剂溶液：
1mL
反应缓冲液
4
毫克溶解
DTNB
测量吸光度
去若干试管，每管加入
50
μL
的
Ellman
试
剂溶液和
2.5mL
反应缓冲液。
加入
250
μL
待测样品
,
空白添加
250
μL
反应缓冲液
在室温混合和反应
15
分钟。
分光光度计
412nm
测定吸光度。
根据
TNB
的摩尔消光系数
(14,150)
计算巯基含量
该国能在
412nm
的合成，有一个相对比较激烈的吸光度
同时二硫化物。
由于蛋白质的巯基，以国能形成化学计量
为
1:1
，国能形成可以用来评估硫醇数目。
在变性剂的情况下，唯一能够找到的硫醇的反应，而
残留的
chaotropic
代理人在场的总数
减少胱氨酸
目前可以衡量的。
经处理后减少的蛋白质
与
chaotropes
及
DTNB
能够产生的半胱氨酸总数（半胱氨酸巯基
加半胱氨酸
-
β
-
半胱氨
酸）。
-
-
反应是敏感的碱性
pH
值（俄亥俄州）与
RS
竞
争），
酸性
pH
值（二硫化物可以打破），氧（
R
的巯基再氧化），以及<
/p>
温度（热致变色）。
因此，通常的反应是
进行了过多的
DTNB
的蛋白质，在中性
pH
值固定的温度，
erature
，有时在厌氧条件。
此外，国能是
敏感的各种离子的缓冲，所以采用消光系数
硫醇数量计算必须正确匹配的反应
条件。
这也是进行了存在的真实反应
尿素或盐酸胍的变性剂（盐酸胍）。
下表概述
在
DTNB
的和国能在各种条件下的一些有用的数据：
---------------
-----------------------------------
------------------------
复方最大的
lambda
（
pH
值
?
7
）灭绝：（以磷酸盐）（以磷酸三）（以盐酸
胍）
---------
----------------- -------------------- ---- ------
----------
DTNB
的
324
纳米
17780 16600
----
国能
----
412
纳米
14,150 13,700
---------------------------
----------------------- ------------------------ <
/p>
消光系数以每摩尔每厘米长度的路径，
30degC
单位
国能在降低盐酸胍存在的灭绝是由于在移位
拉姆达从
412
到
422
最大纳米。
在
DTNB
的灭绝是在
412
纳米
212/M/cm
，
规模虽小但可衡量的。
=-=-=-=-=-=-=-=
=
协议
=
=-=-=-=-=-=-=-=
联合解决方案：
蛋白质溶液（本地或以前减少，脱盐）
（
?
5 - 0.1M
的磷酸钾缓冲液，
pH
值
7.
4 40uM
）
DTNB
的股票（
< br>20
毫米
0.1M
的
KPO4
，
pH
值
7.4
，分子量
396.35; 7.93<
/p>
毫克
/mL
）
（
DTN
B
的很慢进入的解决办法
;
涡定期
在
2-3
小时内实现完整的解决方案，
这将是很轻，颜色黄色）
尿素或盐酸胍（高纯度，结晶固体）
主要设备：
双光束分光光度计动力学模式设置在
412nm
恒温细胞，
30degreesC
程序：
示例
1 =
1.0mL
细胞蛋白质溶液
+ 50
μ
L
20
毫米
DTNB
< br>的
引用单元
1 = 1.0mL+ 50
μL
DTNB
的缓冲区
记录吸光度前，
< br>DTNB
的除了
“
零
”
。
跟随
在
412 nm
的反应在
30degC
不断。
记录过去的时候，
反应达到最大值。
如果任何被视为重要的下坡
最大吸收后到达，这将需要更正
为了获得可访问硫醇的正确数目。
在第二个实验中，添加结晶盐酸胍到您的
蛋白质溶液，以达到最终浓度约
4
米。
请注意
体积变化以及由此产生的蛋白显着的稀释
解决方案！
示例
2
= 1.0mL
细胞蛋白质溶液（
4
M
盐酸胍）
+ 20 mM
的
DTNB
的
50
μL<
/p>
引用单元
2 =
1.0mL
缓冲液（
4
M
盐酸胍）
+ 50
μL
20
毫米
DTNB
的
同样，
在
30
摄氏度的纪录外径
412
纳米，跨越高峰吸收。
本实验将产生硫醇总数减少。
样品细胞
3 =
1.0mL
预变性，减少，蛋白质和透析
+ 5
0
μL
20
毫米
DTNB
的
引用单元
3 =
1.0mL
缓冲液（
4
M
盐酸胍）
+ 20 mM
的
DTNB
的
50
μL<
/p>
同样，
记录
OD
值随时间在
30degC
412 nm
到峰值吸收和超越。
本实验将产生的蛋白质的半胱氨酸残基的总数。
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
数据分析
= =
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
计算硫醇数修改（或浓度除外）使用
在
412
nm
的最大吸收测量（或修正值除外）
啤酒的法律，以及适当的消光系数
;
鸿沟这个值
由精确已知的摩尔反应蛋白浓度比色皿
三个实验的每一个。
这将使你获得硫醇，
总半胱氨酸巯基
，总半胱氨酸巯基以及半胱氨酸
-
β
-
半胱氨酸。
这样做，每个实
验中
重复或一式三份，平均分别复制。
如果您的
数字统计整数，你就大功告成了。
如果不考虑重复
该议定书，但采用厌氧（脱气）缓冲区的所有反应。
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
一些参考
= =
=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=
“
甲硫醇为确定低浓度比色法
”
埃尔曼，吉尔（
1958
）拱。
< br>
生化。
Biophys
。
74
，
44
3-450
。
“
重新评估埃尔曼的试剂
”
谜语，密码，布莱克利，汤顿和泽纳，
二（
19
83
）方法酶学。
91
，
49-60
。
对兔血红素结合半胱氨酸残身份
“
研究
肝微粒体细胞色素
P - 450<
/p>
同工酶
2“
黑色，
SD
和库恩，美兆
（
198
5
）生物化学，
Biophys
。
水库。
Commun
。
128
，
8
2-89
。
Hi All,
I had a couple
of folks ask for my opinion and method for use of
Ellmen's
reagent (DTNB) in the
detemination of protein thiols (Cys-SH).
Below, I've
included a protocol, references, and
general information that should be
helpful to all who anticipate using
this method.
Best Regards,
Shaun
-
-
-
-
-
-
-
-
-
上一篇：从组织文化方面认识欧莱雅公司
下一篇：第六章磁性矿物