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人线粒体
DNA
荧光定量
PCR
检测方法的建立
作者：王学波，李建远
作者单
位：青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院中心实验室，山东
烟台
【摘要】
建立
SYBR Green I
实时荧
光
PCR
定量检测人线粒体
DNA
的方法。
选取人线粒
体
DNA
高度保守基因片段，将该基因片段与
pCF-T
载体连接后，转化入
DH5α
，提
取重组质粒
PCR
及测序鉴定后，作为阳性模
板建立
SYBR-Green
I
荧光
定量
PCR
标准曲
线和熔解曲线。结果
表明：构建的标准曲线线性关系良好
(
反应体系中含
101
～
108
拷贝时<
/p>
,
扩增反应
CT
值与拷贝数的对数成线性关系
)
，
相关
系数为
0.997
。
批内和批间重复性
测定的
变异系数分别为
1.23%
～<
/p>
3.29%
以及
3.10%
～
5.21%
。我们成功建立了实时荧光定量
PCR
检测人线粒体
DNA
< br>的方法，该方法可作为进一步研究线粒体
DNA
的方法，
在相关疾病诊
断和监测中具有一定的应用前景。
【关键词】
SYBR Green I
；荧光定量
PCR
；线粒体
DNA
；聚合酶链反应
；人
Establishment of the
Method for Detecting Human Mitochondrial
DNA with Fluorescence
Quantitative Ploymerase ChainWANG
Xuebo
，
LI Jianyuan
（
The
Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao
Medical University
，
Yantai
264000
，
China
）
Abstract
：
To
estiblish a SYBR-Green I fluorescent quantitative
PCR method to detect
human
mitochondrial mitochondrial DNA was analyzed and
special primers
were designed and
synthesized according to the conserved gene
sequence. The specific
fragment was
cloned into pCF-
T vector which was
transformed into DH5α. The
positive
recombinant plasmid identified by sequencing was
used as quantitative template
to
generate standard curve and melt curve. Results
showed that the standard curve
succesfully showed a linear
relationship between cycle threshold(Ct)and
template
concentration ranging from 101
to 108 copies,and the correlation coefficient was
coefficient of variation values for
both intra-experimental and inter-experimental
reproducibility ranged from 1.23% to
3.29 % and 3.10% to 5.21%, means
that
the method for detecting human mitochondrial DNA
with fluorescence quantitative
polymerase chain reaction is developed
shows good repeatability and
sensitivity in detection of human
mitochondrial DNA. This method can facilitate the
potential applications in the fields of
laboratory diagnosis and detection.
Key words
：
SYBR
Green I; Fluorescent qunantitative PCR;
Mitochondrial DNA
；
Polymerase
chain reaction
；
Human
1
引
言
线粒体作为真核细胞中一种重要而独特的细胞器，其性
状和数量的改变与人的疾病密切
相关。
研究线粒体与疾病的关系
，既有理论意义，
在医学上也有潜在的应用前景。
称为细胞
动力工厂的线粒体，因其生命周期有限，具有高的更新率，形态、大小、数量和分布常因细<
/p>
胞种类不同而异。本研究旨在建立人线粒体
DNA
荧光定量
PCR
方法，为进一步研究线粒
体
DNA
与人的疾病的关系奠定基础。
1
材料与方法
1.1
实验材料
人
EDTA
< br>抗凝血
2
ml
，菌种为本室保存的大肠杆菌
DH5α
。
1.2
试剂
pCF-T
连接试剂盒、
PCR
反应试剂盒、
DNA
产物纯化试剂盒、
琼脂糖凝胶
DNA
回收
试剂盒、质粒提取试剂盒
等购自
TIANGEN
公司；
BigD
ye Terminator v3.1
试剂盒、
SYBR
PCR Mastermix
购自
ABI
公司；人淋巴细胞分离液购自灏洋生物公司。
1.3
仪器
BIO-RAD
公司
iCycler<
/p>
荧光定量
PCR
仪，
HERAEUS
公司高速离心机
BIOFUGEPICO<
/p>
，
ABI
公司
9700 PCR
扩增仪，大和公司恒温金属浴，
BECKMAN
公司紫外分光光度计
DU-640<
/p>
，复星公司电泳仪，
KODAK
公司凝胶
成像系统，
ABI
公司
310
测序仪。
1.4
目的片段引物的设计、合成
比较人线粒体
DNA
全序列，设计特异
引物，引物由三博远志合成，序列如下
:
上游引物：
5′
-ATACCCATGACCAACCTCCTACTCCTCATT-<
/p>
3′
；
下游引物：
5′
-CTGCTCGCAGTGCGCCGATCAGGGCGTAGT-<
/p>
3′
。
1.5
DNA
样品的提取、扩增及回收
取人
EDTA
抗凝血
2 ml
，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核
细胞，分别吸取人单个核
细胞（
1×
1
06/mL
）
5
ul
，离心，弃上清。放入
20
ul
裂解液中
(Chelex reagent),
56
℃
消化
1
h
，
98
℃
10 min, DNA
样品
-20<
/p>
℃保存。
PCR
反应体系：
上下游引物各
1 ul
（
10
umol/L
）
、
dNTPS 2
ul
、
Taq
DNA
聚合酶
0.5
ul
、
10×
Taq Buffer
2.5 ul
、
DNA
样品
2 ul
、
ddH2O 16 ul,
轻轻混匀，短暂离心，按照下列条件进行扩增
:94
℃预变性
5 min
；
95
℃
30
s
、
55
℃
45
s
、
72
℃
45 s,
共
35
个循环；
72
℃延伸
3 min<
/p>
。
PCR
产物于琼脂糖凝胶上进行电泳、
检测，并
用胶回收试剂盒纯化回收。
1.6
克隆载体的构建
回收的片段与
载体连接，
产物转化
DH5α
菌，
然后利用
Amp
抗性进行筛选。
从
平板中挑出
7
株转化菌，按质粒抽提试
剂盒提供的方案配液、提取。对质粒进行
PCR
电泳
鉴定，鉴定阳性的质粒用测序证实。
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