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一、
HBV DNA
荧光定量
PCR
技术
（一）
标本
血清、血浆（其它如组织细胞、乳汁、精子、尿液等体液）；
标本应封闭保存，
特别
在夏季，如果
标本暴露的过久，
开盖保存，很容易出现水分蒸发，
检测结果和
上一次的检测
结果会有较大的差异。
环境条件影响不大，
比如保存在
-8
°、
-20
°、
24
°、
还是室温，
对高中低病毒含量的最后的检测结果影响不是太大，只要封闭保存就
可以。因此
可常温运
输，但不可泄露。
（二）
检测方法
国内最常使用
PEG
（
聚乙二醇方法
）法进行核酸提取，采用
TaqMan
探针进行荧光
PCR
扩增。
扩增
40
循环进行结果分析，
如下图一所示：
典型的双
S
形的曲线图，越早出<
/p>
现荧光曲线的病毒含量越高，
越晚越低。
根据不同的梯度的四个标准品进行定量。
如果血清
或标本里面没
有病毒，
就是一个阴性直线。
最近我们在彻底解决污染问题之后采用扩增
50
个循环的方法。
优点是让扩增管里的
反应液充分反应，缺点是如果实验室存在一个潜在的
污染或操作人员操作习惯不好，
很容易出现携带污染，
造成假阳性。
对实验
室的来说不应该
通过减少扩增的循环数来解决污染问题，
而应该
通过科学的管理，
提高试剂的质量，
以及养
成一个良好的操作习惯，
或防污染的习惯来解决假阳性的问题。
增加循环数有利于标本检测
结果的判断，这将来可能是实验室发展的一个趋向。
COBAS
TaqMan
技术在我们
国家已经有
好多实验室有这种全自动的核酸提取扩增系统，
它的
优势重点在于检测病毒含量比较低的血
清标本，但是对于病毒含量比较高的，往往出现荧
光
PCR
竞争的缺点。
图一为：
PCR
扩增曲线
（三）污染的预防与排除
PCR
扩增产物污染是
PCR
反应中最主
要最常见的污染问题，
所以扩增区的仪器如枪头
等要注意。最可
能造成
PCR
产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体
面摩擦时就可形
成气溶胶，
在操作时比较剧烈地摇动反应管，<
/p>
开盖时、
吸样时及污染进样枪的反复吸样都可
形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含
48000
拷贝
,
因而由其造成
的污染是一个
值得特别重视的问题。标本处理区，包括扩增摸板的制备；
PCR
扩增区，包括反应液的配
制和
PCR
扩增；产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有
一定的隔离，
操作器材专用，
要有一定的方向性
。
如：
标本制备
→
PCR
扩增
→
产物分析
→
产物处理。切记
:
产物分析区的产
物及器材不要拿到其他两个工作区。使用一次性吸头，
严禁与
PCR
产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。<
/p>
（四）常用仪器
常用的
PCR
仪器：
ABI
系列、罗氏系列、安捷伦系列、国产
SLAN
等。
（五）临床意义
检测血清或血浆
HBV DNA
阳性有什么临床意义？
1.
判断血清中是否有
HBV DNA
的存在
我们检测到的
HBV
DNA
包括
完整
HBV
病毒和
DNA
片段。
目前我们用的
HBV
DNA
荧
光
PCR
法，还不能区分是完整病毒还是片段。只要检测到的病毒载量在检测线以上就可以
定为
标本含有
HBV DNA
。
2.
判断抗病毒疗效的评估指标
细胞内
HBV DNA
和
HBV DNA
确认方法。
病人采用各种抗病毒药物
，比如拉米夫定、
阿德福韦、
恩替卡韦或替米夫定等抗病毒药物
，
因为这些药可以有效的抑制病毒复制，
用药
< br>之前或用药之后，病人的血清里或外周血白细胞里是不是还有病毒的存在？病毒下降了多
< br>少？是不是有病毒的反弹？这是临床医生关心的问题。
随着抗病毒药物用药时间的
延长，
有
些病人血清里面的
HBV
DNA
一直处于检测线以下。因此目前临床医生有一些新的需求，就
< br>是能不能确认病人血清里究竟有没有
HBV DNA
。不同的实验室报告检测低限值不一样，有
的实验室报
<1000 IU
，有的实验室报
<100 IU
，
COBAS TaqMan<12
个，
<12
个还是有
病毒，血清里究竟有多少个？是临床急需的一种
HBV DNA
确认方法。即确认血清里面究竟
有没有病毒。现在已经提出一种检测方法
。
DNA
阳性与传染性
感染乙肝病毒
必须达到一定的量，突破各种屏障（
血液里的补体、细胞因子、抗体
等
），进入肝细胞复制，
才能达到传染性的要求，因此并不是接触到病毒都会被感染
。
HBeAg
的产生与意义→
HBeAg
与
HBV DNA
清除的不平衡带来的异常模式
→
HBsAg
的包
裹与剪切
（完整
HBV
形成）
→
不同形式
HBsAg
的产生与意义。
抗
HBc
、
抗
HBe
和抗
HBs
的产生。
四，
HBV
DNA
定量与乙肝血清学模式不同组合的意义。
大三阳
（
表面抗原、
E
抗
原和核心抗体阳性
）
并抗
HBs
阳性：
HBsAg/IgM
。
E
抗原阳性说明病人体内的乙肝
病毒
处于一种活跃性的复制状态。这时有的病人合并表面抗体的阳性，是不是获得一定的
抵抗
力？不是。
表面抗体往往是病毒复制时诱发了机体免疫答应
而产生相应的抗体，
这个抗体是
针对表面抗原的
IgM
大蛋白抗体。因此它是机体对乙肝病毒复制免疫反抗的结果。这时要
提高病人或保持病人的免疫功能
；
小三阳并抗
HBs
阳性：
病毒活动性复制、
不同型病毒的
感染等
；
抗
HBs
或抗
HBc
与
HBV DNA
同时阳性：细胞内
HBV
的释放。
4.
血清游离和细胞内
HBV
检测与抗病毒治疗的关系
乙肝病人
体内的病毒分成两个病毒状态，一个是游离的病毒，一个是细胞内的病毒，
包括肝细胞和
血细胞。
游离的病毒意味着要被清除掉的病毒，
除了个别的病毒
再进入肝细胞，
进行感染肝细胞。
而细胞内的病毒与抗病毒治疗
的效果更有直接的关系，
如果要彻底清除乙
肝病毒，
最终检测肝脏细胞里病毒是阴性。
但是肝穿只能局限于肝穿的组织，
不能代表整个
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