-
一、
USP
方法
5.2.12
抗
IIa
活性（
20.0~35.0IU/mg
）
< br>
5.2.12.1
仪器：紫外可见分光光度计、低温循
环槽、电子天平
5.2.12.2
试液：
醋酸溶液：取冰乙酸
42ml
于
< br>100ml
容量瓶中，加水稀释
至刻度，混匀。
pH7.4
聚乙二醇
6000
缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷
6.08g
和氯化钠
8.77g
于
1
000ml
容量瓶中，
加水
500ml
溶解后，
加聚乙二醇
6000
1.0g
，用盐酸调节
pH
< br>至
7.4
，加水稀释至刻
度。<
/p>
pH7.4
缓冲溶液：
称取三羟甲基氨基甲烷
6.08g
和氯化钠
8.77g
于
1000ml
容量瓶中，加水
500ml
溶解后，用盐酸调节
pH
至
7.4
，加水稀释至
刻度。
pH
8.4
缓冲溶液：称取三羟甲基氨基甲烷
3.03g
、氯化钠
5.12g
和乙二胺四乙酸二钠
1.4
0g
于
500ml
容量瓶中，加水
250ml
溶解后，用盐酸调节
pH
至
8.4
，加水稀释至刻度。
抗凝血酶
III
溶液：取<
/p>
1
支抗凝血酶
III
，加水溶解成
5Units/ml
。
用
pH7.4
聚乙二醇
6000
缓冲液稀释成
0.5Unit/ml
。
人凝血酶溶液：
用水将人凝血酶复溶，<
/p>
用
pH7.4
聚乙二醇
< br>6000
缓冲液稀释成
5Units/ml
。
显色底物：
选择适合凝
血酶的阿米酚试验的显色底物，
用
水稀释成浓度约
3mmol/L
。临用前用
pH
8.4
缓冲溶液稀释至
0.5
mmol/L
。
标准溶液：用
pH 7.4
缓冲溶液将
USP
依诺肝素钠活性标
准品稀释为浓
度
0.015~0.070USPIU/ml
之间的四个浓度梯
度。
样品溶液：用
pH 7.4
缓冲溶液将依诺肝素钠样品稀释为
与标准溶液浓度一致的浓度梯度。
5.2.11.3
检测过程：取
18
支检测管，
B
1
、
B
2
为空
白；
T
1
、
T
2
、
T
3
、
T
4
为样品溶液
，各双份平行；
S
1
、
S
2
、
S
3
、
S
4
为标准溶液，各双
份平行。按
B
1
、
S
1
、
S
2
、
S
3
、
S
4
< br>、
T
1
、
T
2
、
T
3
、
T
4
、
T
1
、
T
2
、
T
3
、
T
4
、
< br>S
1
、
S
2
、
S
3
、
S
4
、
B
2
的顺序，每管中加入抗凝血酶
III
的体
积为
V
（
20~50
μ
l
）
，和同样体积的
pH
7.4
缓冲溶液（空白）
、
标准溶液或样品溶液；混合
，但不要产生气泡。于
37
℃温浴
1<
/p>
分钟。向每管中加入
2V
人凝血酶溶液（
40~100
μ
l
）
，温浴
1
分钟。
再加入
5V
显色底物
（
100~250
μ
l
）
，
4
分钟后加入
5V
的醋酸溶液（
100~250
μ
l
）终止反应。以
B
1
为空白，用紫外
可见分光光度计在
< br>405nm
处测量光吸收。空白
B
2
的吸收值相
比
B
< br>1
不得超过±
0.05
。
5.2.12.4
计算
对每个浓度系列，将光吸收回归，与样品溶液和标准溶液
的浓度对数值作线性
分析。然后以量平行线分析统计方法计算
每
mL
中依诺肝素钠抗
IIa
因子
I
U
活性。
4
个浓度溶液的计算
值组合计算得到最终的平均值，然后计算可信限度。抗
IIa
因
子用
IU/mg
表示，
按干品计。两人结果的相对平均偏差不得超
过
5.0%
。
5.2.13
抗<
/p>
Xa
因子活性（
90~125IU/mg
）
5.2.13.1
仪器：紫外可见分光光度计、低温循环槽、电子天平
5.2.13.2
试液：
醋酸溶液、
pH7.4
聚乙二醇
< br>6000
缓冲液、
pH7.4
缓
冲溶液、
pH 8.4
缓冲溶液同抗
I
Ia
因子检测。
抗凝血酶
III
：取
1
支抗凝血酶
III
，加水溶解成
5Units/m
l
。
用
pH7.4
聚乙二醇
6000
缓冲液稀释成
1
.0Unit/ml
。
Xa
因子溶液：用
pH7.4
聚乙二醇
6000
缓冲液稀释，使之
在下述检测中
405nm
处光吸收每分钟增加不超过
0.20<
/p>
，
但要用
体积为
V
的
pH7.4
的缓冲液代替依诺肝素钠溶液。
< br>显色底物：选择适合
Xa
因子的阿米酚试验的显色底物，
用水稀释成浓度约
3mmol/L
。<
/p>
临用前用
pH
8.4
缓冲溶液稀释至
0.5
mmol/L
。
标准溶液：用
pH 7.4
缓冲溶液将
USP
依诺肝素钠活性标
准品稀释为浓
度
0.076~0.180
USP
IU/ml
之间的四个浓度梯度。
样品溶液：用
pH 7.4
缓冲溶液将
依诺肝素钠样品稀释为
与标准溶液浓度一致的浓度梯度。
5.2.13.3
检测过程：取
18
支检测管，
B
1
、<
/p>
B
2
为空白；
T
1
、
T
2
、
T
3
、
T
4
为样品溶液，各双份平行；
S
1
、
S
2
、
S
3
、
S
4
为标准溶液，各双
份平行。按
B
1
、
S
1
、
S
2
、
S
3
< br>、
S
4
、
T
1
、
T
2
、
T
3
、
T
4
、
T
1
、
T
2
、
T
3
、
< br>T
4
、
S
1
、
S
2
、
S
3
、
S
4
、
B
2
的顺序，每管中加入抗凝血酶
III
的体
积为
V
（
20~50
μ
l
）
，和同
样体积的
pH 7.4
缓冲溶液、标准
溶液或样品溶液；混合，但不要产生气泡。于
37
℃温浴
1
分
钟。
向每管中加
入
2VXa
因子溶液
（
40~100
μ
l
）
，
温浴
1
分钟。
再加入
5V
显色底物（
100~250
μ
l
）
，
4
分钟后加入
5V
的醋酸
溶液（
100~250
μ
l
）终止反应。以
B
1
为空白，用紫外可见分
光光度计在
405nm
处测量光吸收。空白
B
2
的吸收值相比
B
1
不
得超过±
0.05
。
5.2.13.4
计算
对每个浓度系列，
将光吸收的回归，
与样品溶液和标
准溶
液的浓度对数值作线性分析。
然后以量平行线分析统计方法
计
算每
mL
中依诺肝素钠抗
Xa
因子
IU
活性。
4
个浓度溶液的活性
对数值组合计算得到最
终的几何平均值，同时计算可信限度。
抗
Xa
< br>因子用
IU/mg
表示，按干品计。两人结果的相对平均
偏
差不得超过
2.0%
。
二、
EP
方法
5.2.14
抗
FXa
因子和抗
F
Ⅱ
a
因子活性检测：
（
2
人检
测）
5.2.14.1.
溶液的配制
5.2.14.1.1
缓冲液的制备
5.2.14.1.1.1
三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液<
/p>
(pH 7.4)
：
< br>溶解三羟甲基氨基甲烷
6.08g
和氯化钠
8.77g
于纯化水
500ml
中，加牛血清蛋白
10g
。用盐酸（取浓盐酸
85
ml
用
蒸馏水稀释到
1000
ml
，以下所用盐酸无特殊
要求外，指此
浓度盐酸）调节
pH
至<
/p>
7.4
，用纯化水稀释到
1000
ml
。
5.2.14.1.1.2
三羟甲基氨基甲烷
-EDTA
缓冲液<
/p>
(pH 8.4)
：
溶解氯化钠
5.
12g
和三羟甲基氨基甲烷
3.03g
和
EDTA
二
钠
1.4g
于纯化水
250ml
中。<
/p>
用盐酸调节
pH
至
8.4
，
用纯化
水稀释到
500 ml
。
5.2
.14.1.2
显色底物的制备：
5
.2.14.1.2.1
显色底物
R1(N-
< br>α
-
苄氧基羰基
-D-
精氨酰基
-L-
甘氨酰
基
-L-
精氨酸
-4-
硝基苯胺的二氢氯化物
)
：
显色底物
S-2765
：用水溶解显色
底物成
3mmol/L
的溶液。
临用前
用三羟甲基氨基甲烷
-EDTA
缓冲液
(pH 8.4)
稀释成
0.5mmol/L
< br>的溶液。
5.2.14.1.2.2
< br>显色底物
R2(D-
苯基丙氨酰基
-pipecolyl-L-
精氨酸
-4-
< br>硝基苯胺的二氢氯化物水溶液
)
：
显色底物
S-2238
：用水溶解
显色底物成
3mmol/L
的溶液。
临
用前用三羟甲基氨基甲烷
-EDTA
缓冲液
(pH 8.4)
稀释成
0.5mmol/L
的溶液。
5.2.14.1.3
< br>牛
Xa
因子参照液的制备：
<
/p>
Xa
因子溶液：取
Xa
< br>因子
1
瓶，加
pH7.4
缓冲液
10ml
溶解并
稀释。
5.2.14.1.4 Antithrombin
(
抗凝血酶
)
：
用三羟甲基氨基甲烷的氯化钠缓冲液
(pH 7.4)
配制成含
5IU/ml
的溶液，在
2~8
℃下保存。
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