γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)说明书

2021年2月18日发(作者：pug)

货号：

MS1207

规格：

100

管

/96

样

γ

-

谷氨酰半胱氨酸连接酶（

GCL

） 说明书

微量法

注意：正式测定之前选择

2-3

个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GCL

< br>是

GSH

合成的限速酶，

GSH

对

GCL

有反馈抑制作用。

< p>
GCL

基因表达受多种因素调节，如氧

化剂、

抗氧化剂、

生长因子和炎症因子等。

GCL

活性高低对

GSH

含量和

GSH/GSSG

比值有重要影响。

测定原理：

在

ATP

和

Mg

2+

< br>存在下，

GCL

催化谷氨酸和半胱氨酸合成

γ

-

谷氨酰半胱氨酸；同时

ATP

去磷酸

化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即 可计算出

GCL

活性。

自备仪器和用品：

冷冻离心机、水浴 锅、移液器、可见分光光度计

/

酶标仪、微量玻璃比色皿

/96

孔板、浓硫

酸和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×

1

瓶，

4

℃保存。

试剂二：粉剂×

1

瓶，

4

℃保存。临用前加

6mL

蒸馏水充分震荡溶解。

试剂三：粉剂×

1

管，

4

℃保存。临用前加入蒸馏水

1.5mL

< p>
充分震荡溶解。

试剂四：液体×

1

瓶，室温保存。

试剂五：

粉剂×

1

< br>瓶，

4

℃保存。

临用前加入

12

mL

蒸馏水，

充分震荡溶解后，

缓缓加入400?L

浓硫酸（自备），边加 边搅拌。

粗酶液提取：

1.

组织：按照组织质量（

g

）：试剂一体积

(mL)

为

< br>1

：

5~10

的比例（建议称取 约

0.1g

组织，加

入

1mL

试剂一）进行冰浴匀浆。

8000g

< p>
，

4

℃离心

10min< /p>

，取上清，置冰上待测。

2.

细菌、真菌：按照细胞数量（

10

4

个）：试剂一体积（

mL

）为

< br>500~1000

：

1

的比例（ 建议

500

万细胞加入

1mL

试剂一）

，

冰浴超声波破碎细胞

（功率

300w

，

超声

3

秒，

间隔

7

秒，

总时间

3min

）

；

然后

8000g

< br>，

4

℃，离心

10min

，取上清置于冰上待测。

3.

血清等液体：直接测定。

GCL

测定操作：

1.

< br>分光光度计

/

酶标仪预热

30m in

，调节波长到

660nm

，蒸馏水 调零。

2.

空白管：取

< p>
1.5mLEp

管，依次加入试剂一72?L、试剂二52?L 和试剂三 12?L，混匀后盖紧，

37

℃水浴准确反应

< br>15min

；

再加入试剂四60?L，

< br>混匀后，

室温

（

25

< p>
℃左右）

8000g

，

离 心

10

min

，

取上清100?L，加入试剂五100?L，混匀后盖紧，

45

℃水浴

10min

，冷却后测定

6 60nm

处光吸

收，记为

A

< p>
空白管。

3.

测定管：取

1.5mL Ep

管，依次 加入试剂一48?L、试剂二52?L、试剂三12?L和上清液24?L，

混匀后盖紧 ，

37

℃水浴准确反应

15 min< /p>

；再加入试剂四60?L，混匀后，室温（

25

< br>℃左右）

8000g

，离心

10 min

，取上清100?L，加入试剂五100?L，混匀后盖紧，

45

℃水浴

10min

，冷却

后测定

660nm

处光吸收，记为

A

测定管。

注意：

空白管只需测定一次。

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