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细菌
DNA
的提取方法
针对一些不易于提取的细菌的方法
:
试验试剂：
抽提缓冲液：
2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)
（去色素）
100mMTris-HCl
25mMEDTA
10MLiCl
2MLiCl
DEPC-water
（抑制
RNA
酶活性）
3MNaAc
96%
乙醇
70%
乙醇
试验步骤：
1
、抽提缓冲液
65
℃预热。
2
、
加菌体到已经预热的缓冲液
（
700ul
）
中混匀，<
/p>
65
℃，
10min
。
3
、加酚
/
氯仿
/
异戊醇（
25
：
24
：
1
），
振荡，以
12,000
rpm
，离心
10min
。
4
、取上清，加氯仿
/
异戊醇（
24
：
1
）
振荡，以
12,000rpm<
/p>
，离心
10min
。
5
、重复再作一次步骤
4
。
6
、加入
1/10
体积的
3M
醋酸钠和倍体
积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－
20C<
/p>
下沉淀。
7
、
以
2,000rpm
，离心
10min
。
8
、弃上
清，以
70
％乙醇条洗沉淀，也
可以再
用
100
％乙醇洗，
然后溶解于
100ml
水中。
较为常用的细菌
DNA
提取方法：
实验步骤：
1
、将菌株接种于液体
LB
培养基，
37
℃
震荡培养过夜。
2
、取培养物
12000rpm
离心
2min
。
3
、沉淀中加入
567ul
的
TE
缓冲液，反
复
吹打使之重新悬浮，加入
30ul10%SDS
和
15ul
的蛋白酶
K
，混匀
，于
37
℃温育
1h.
4
、加入
100ul5mo
l/LNaCl,
充分混匀，再
加入
8
0ulCTAB/NaCl
溶液，混匀后再
65
℃
温育
10min
。
5
、加入等体积的酚
/
氯仿
/
异戊醇混匀，
离心
4-5min,
将上清转入一只新管中，
加入
倍体积的异丙醇，
轻轻混合直到
DNA
沉淀
下来，沉淀可稍加离心。
6
、沉淀用
1ml
的
70%
乙醇洗涤后，离
心弃乙醇．
真菌
DNA
提取总结的两种方法：
第一种方法：
试验步骤：
1
、
取真菌菌丝
,
在液氮中迅速研磨成
粉。
2
、加入
4mL
提取液，快速振荡混匀。
3
、加入等体积的
4mL
的氯仿
:
异戊醇
(24:1)
，
涡旋
3
～
5
min
（此处是粗提没有加
酚）。
<
/p>
4
、以
4
℃，<
/p>
1000rpm
，离心
5min
。
5
、
上清再用等体积的氯仿
:
异戊醇
(24:1)
抽提一次。
以
4
℃，
10,000rpm
，
离心
5min
。
6
、取上清，加入
2/3
倍体积的
-20
℃预
冷的异丙醇或倍体
积的无水乙醇沉淀
,
混
匀
,
静置约
30min
。
7
、用毛细玻棒挑出絮状沉淀
,
用
75%
乙
醇反复漂洗数次
,
再用无水乙醇漂洗
1
次
,
吹干，重悬于
500ulTE
中。
8
、加入
1ulRNaseA
（
10mg/mL
），
37
< br>℃
下处理
1h
。
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