-
Tris
是什么？有什么作用？
Tris-
HCl
，
Tris-
EDTA
如何配制？
Tris
：三羟甲基氨基甲烷
三羟甲基氨基甲烷
（
Tris(hydro
xymethyl)aminomethane
，
一般简称为<
/p>
Tris
）
是一种有机化合物，
其分子式为
(HOCH2)3CNH2
。
Tris
被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。
例如，在生物化学实验中常用的
TAE
和
TBE
缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到
Tris
。由
于它含有氨基因此可以与醛发生缩合反应
Tris
为弱碱，在室
温（
25
℃下，它的
pKa
为
8.1
；根据缓冲理论，
Tris
缓冲液的有效缓冲范
围在
p
H7.0
到
9.2
之间。
Tris
碱的水溶液
p
H
在
10.5
左右，
< br>一般加入盐酸以调节
pH
值至所需值，
< br>即可获得该
pH
值的
缓冲液。但
同时应注意温度对于
Tris
的
pKa
的影响。
由于
Tris
缓冲液为弱碱性溶液，
DNA
在这样的溶液中会被去质子化，
从而提高其溶
解性。
人们常常在
Tris
盐酸缓冲液
中加入
EDTA
制成“
TE
缓冲液”
，
TE
缓冲液被
用于
DNA
的稳定和
储存。如果将调节
pH
值的酸溶液换成乙酸，则获得“
T
AE
缓冲液”
（
Tris/Aceta
te/EDTA
）
，而
换成硼酸则获得
“
TBE
缓冲液”
（
< br>Tris/Borate/EDTA
）
。这两种缓冲液通
常用于核酸电泳实验
中。
用途：有机
合成中间体。在电泳缓冲液中同甘氨酸构成缓冲体系，稳定电泳过程中的
PH
值。在凝胶中也起到稳定
PH
的作用，只不过是<
/p>
Tris-HCl
缓冲体系。
Tris
缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶
剂，
还有许多重要用途。
Tris
被用
于不同
pH
条件下的蛋白质晶体生长。
Tris
缓冲液的低离子强度特点可用于线虫
（
C. elegans
核纤层蛋白
lamin
）的中间纤维的形成。
Tris
也是蛋白质电泳
缓冲液的主要成分之一。此外，
Tris
还是制
备表面活性剂、硫化促进剂和一些药物的中间物。
Tris
也被用作滴定标准物。
1 M Tris-HCl (pH7.4
，
< br>7.6
，
8.0)
组份浓度
1 M Tris-HCl
配制量
1L
配制方法：
1.
称量
121.1 g
Tris
置于
l
L
烧杯中。
2.
加入约
800
ml
的去离子水，
充分搅拌溶解。
3
.
按下表加入浓
HCl
量调节所需要的
pH
值。
pH
值
浓
HCl 7.4
约
70 ml 7.6
约
60 ml 8.0
约
42ml
4.
将溶液定容至
1
L
。
5.
高温高压灭菌后，室温保存。
<
/p>
注意：应使溶液冷却至室温后再调定
pH
值，因为
Tris
溶液
的
pH
值随温度的变化差异很大，温度每升高
1
℃，溶液的
pH
值大约降低
< br>0.03
个单位。
1.5 M Tris-HCl (pH8.8)
组份浓度
1.5 MTris-HCl
配制量
1 L
配制方法
1.
称量
181.7 g
Tris
置于
1
L
烧杯中。
2.
加入约
800
ml
的去离子水，充分搅拌溶解。
3.
用浓
HCl
调节
pH
值至
8.8
。
4.
将溶液定容
至
1
L
。
5.
高温高压灭菌后，室温保存。
<
/p>
注意：应使溶液冷却至室温后再调定
pH
值，因为
Tris
溶液
的
pH
值随温度的变化差异很大，温度每升高
1
℃，溶液的
pH
值大约降低
< br>0.03
个单位。
TE
即
Tris-EDTA
buffer
（
10mM
Tris
，
1mM
EDTA
，
pH7.4 pH7.6
pH8.0
）
。
< br>常用分子生物学试剂，用于
DNA
的溶解等。
配制
1
0
×
TE Buffer (pH7.4,
7.6
，
8.0)
组份浓度：
100 mM Tris-
HCl
，
10 mM EDTA
配制量：
1 L
配制方法：
1.
量取下列溶液，置于
l
L
烧杯中。
1 M Tris-
HCl Buffer(pH7.4
，
7.6
< br>，
8.0) 100 ml 500 mM
EDTA(pH8.0) 20 ml
2.
向烧杯中加入约
800
ml
的去离子水，
均匀混合。
3.
将溶液定容至
1
L
后，
高温高压灭菌。
4.
室温保存。
Β
< br>-
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（
β
-
Nicotinamide adenine dinucleotide
，
NAD
）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基本信息介绍
也称为二磷酸吡啶核苷酸（
DPN
）
，或辅脱氢酶（
codehydrogenase
）
I
或辅酶
I
，是一种转递
质子（更准确说是氢离子）的辅酶，它出现在细胞很多代谢反应中。
NADH
（更准确写法：
NADH +
H+
）是其还原形式。
CAS
：
53-84-9
分子式：
C21H27N7O14P2
EINECS
：
-200-184-4
分子量：
663.425 g
·
mol
?
1
比
旋光度：
[
α
]2
3
D -34.8
°
(1%
，水
)
；
NAD
极易吸湿，储存温度
-20
℃。其固体在干燥器内
0
℃或室温时稳定；在中
性或微酸性溶
液（
pH3
～
7)
中，
0
℃时可稳定<
/p>
2
周以上；在碱性溶液中极易变质；加热易分解。
NAD
溶于
水（
50mg/m
L
）
，不溶于丙酮等有机溶剂；
pH7
.5
时最大吸收波长
259nm(
ε<
/p>
17800)
，最小吸
收波长
230nm(
ε
8000)
。
NAD+
是脱氢酶的辅酶，如乙醇脱氢酶（
ADH
）
，在糖酵解、糖异生、三羧酸循环及呼吸链中
发挥着不可替代的作用。
中间产物会将脱下的氢递给
NAD
，使之成为
< br>NADH + H+
。而
NADH + H+
则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成
ATP
。
NAD
的氧化和还原
NAD
的吸光曲线
在吸光方面，<
/p>
NADH+H+
在
260nm
和
340nm
处各有一吸收峰，而
NAD+
则只有
260nm
一处吸收峰，这是区别两者的重要属性。这同时也是很多代谢试验中，测量
代谢率的物理
依据。
NAD
在
260nm
的吸光系数为
1.78*104 L /(mol*cm)
，而
NADH
在
340nm<
/p>
的吸光系数为
6.2*10
?
L/(mol*cm)
。
制备方法
目前工业中大量的烟酰胺
腺嘌呤二核苷酸产品主要为从酵母中提取分离获得。
该过程虽然工
艺成熟，但是耗费能源和材料巨大，产品昂贵，限制了的生产和其后续应用过程的开发。
流程：
新鲜压榨酵母
?
[
破壁，提取
]
?
提取液
?
[
分离
]
?
滤液
?
[
一次吸附
][
洗脱
]
?
一次洗脱
液
?
[
中和
]
[
二次吸附
][
洗脱
< br>][
三次吸附
][
洗脱
]
?
三次洗脱液
?
[
沉淀
]
[
过滤
][
干燥
]
?
辅酶
I
1
、破壁、提取、分离
将新鲜压榨
酵母搅拌下加入等量沸水，加热至
95
℃保温
< br>5min
，迅速加入两倍酵母质量的冰
块，过滤，滤饼用
水洗涤
2
次，合并滤液和洗液，加入强碱性季铵
I
型阴离子交换树脂
201
×
7(717)
，搅拌
16h
，过滤，收集滤液。
2
、吸附、洗脱
滤液用浓盐酸调<
/p>
pH=2-2.5
，
经弱酸性丙烯酸系阳
离子交换树脂
122
柱吸附，
用无热原
水洗至
流出液澄清为止，再用
0.3mol/L
氢氧化铵溶液洗脱，当流出液呈淡咖啡色，经
340nm
分光
光度计测定吸光度大于
0.05
时，开始收集，流出液呈淡黄色时停止，得一次洗脱液。
3
、中
和、吸附、洗脱
将强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂
001
×
7(732)
加至洗脱液中，搅拌测
pH=5
-7
，过滤，滤饼
用无热原水洗涤，合并洗液和滤液，加稀氨水
调
pH
值至
7(
约
15%)
，再用强碱性季铵
I
型阴
离子交换树脂
201
< br>×
7 (717)50-60
目柱进行吸附，用无热原水
洗至流出液澄清无色为止。
将
76
6
型活性炭
60-80
目柱与
201
×
7
树脂柱串联
，用
0.1mol/L
氯化钾溶液洗脱，洗脱液立
即流经活性炭柱进行吸附，吸附完后解除两柱串联，用
pH9
的无热原水洗涤，再用
pH8
的
4%
乙醇洗涤，最后用无热原水洗至中性，用体积比为丙酮：乙酸乙酯：水：浓氨水<
/p>
=4
：
1
：
5
：
0.02
的混
合液
洗
脱，当洗脱液加
3
倍丙酮产生白色浑浊时，收集洗脱液。
4
、沉淀、过滤、干燥
洗脱液在搅拌下加
30%-40%
硝酸调
pH=2-2.5
，过滤，冰库过夜，过滤，
95%
的冷丙酮洗涤，
真空干燥，得成品。
生物催化法：
申请号：
CN 102605026 A
发明名称：一种氧化型辅酶工的制备方法
申请人：苏州汉酶生物技术有限公司
技术方案：
一种氧化型辅酶工的制
备方法，该方法使烟酰胺核苷
(NR)
和三磷酸腺苷二钠盐
(ATP-Na2)
在
pH
为
5. 0}8. 0
的缓冲溶液中，在烟酰胺核苷激
酶
(NRK)
的催化作用下以及二价金属离子存在
下，在温度
30
℃
-40<
/p>
℃下反应得到氧化型辅酶
I(NAD
十<
/p>
)
。本发明采用生物催化的方法，利用
烟
酰胺核苷激酶一锅法制备氧化型辅酶，
反应体系简单，
条件温和
，
具备良好的产业化应用
前景。
具体实施方式：
在
20
mL
三口烧瓶中加入
10 mL Tris-
HCl
缓冲溶液
(100
mM,pH
为
7. 5)
，依次加入烟
酰胺核苷
（
J,Med. Chem 2007,
50, 0458-0401) 50
mg
，三磷酸腺苷二钠盐
55
mg
，烟酰胺核苷激酶
(PLOS Biology,
2007, 5 (10), 2220- 2230)10
mg,
氯化镁
20 mM
，
于
37
℃下，
200rp
m
搅拌反应，
利用液相色谱一质谱联用监测反应的转化率，
经过
6
小时反应后，
检测三磷酸腺苷已经消耗
完毕，停止反应。通过进一步的过滤，
HZ-818
型大孔树脂吸附，冻干，乙醇和水重结晶即
可获
得氧化型辅酶
I
产品，收率
70%
。
ATP
试剂配置
1
．标准物质配置
1.1
取
1mgATP
标
准
物
质
溶
解
于
1.81ml
水<
/p>
中
配
置
成
：
nATP=0.001g /551.1 g/mol=0.m
mol cATP=0.m
mol/1.81ml=0.0010025
mol/L=1m mol/L 1.2
取
1ml
的
（
1.1
）
cATP=1m mol
/L
加入
100ml
容量瓶，
然后加水加至刻度
线，配置成
cATP
=10u mol/L=10000n mol/L
1.3
取
1ml
的（
1.2
）
cATP=10u mol/L
加入
100ml
容量瓶，然后加水加至刻度线，配置成
cATP =100n mol/L
2.
检测试剂的配置
2.1
取
3.5ml
缓冲溶液加入到检测试剂
瓶中，充分溶解摇匀，待用。
实验
三、
HCl
标准溶液的配制与标定
一、实验目的：
1
、学会酸的配制方法；
2
、掌握酸的标定方法；
二、实验原理：
先用间接法配制好
HCl
溶液；
标定
HCl
标准溶液的浓度可选用基准物无水
Na2CO3
或硼砂；
以甲基橙作为指示剂。
Na2CO3 + 2 HCl ==== 2NaCl + H2O + CO2
三、仪器和试剂
仪器：
50ml
酸式滴定、三角瓶、小烧杯、
25ml<
/p>
移液管、玻璃棒、
250ml
容量瓶、
胶头滴管、
10ml
量筒、洗瓶、废液缸。
试剂：浓
HCl
（密度为
1.19g/ml
、百分
含量为
36.5%
）
、无水
Na
2CO3
、
甲基橙指示剂
四、实验步骤：
1
、配制
250ml 0.1mol
/ L HCl
溶液
准备：洗涤所用仪器
1)
计算：所需浓
HCl
的体积。
2)
量取：用量筒量取浓
HCl
< br>。
3)
溶解：
加约
30 ml
的水进行溶解，
直到冷却。
4)
转移：
借助玻璃棒转移到容量瓶中。
5)
洗
涤：
所洗溶液也全部转移到容
量瓶中。
6)
定容：加水至刻度。
7)
摇匀：
把溶液摇均匀。
8
）
贴上标签。
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