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阿尔新蓝、阿尔新蓝
-
茜素红染色
1
、阿尔新蓝染液
100%
乙醇
80ml
冰醋酸
20ml
alcian blue 8 GX
0.1g
充分混匀溶解后，
37
°静置过夜。
2
、无酸双染色剂（阿尔新蓝—茜素红
S
）
A
液：
alcian blue
8 GX
用于软骨染色。
首先将阿尔
新蓝粉末溶解到
50%
的乙醇中，
37
°孵育并摇匀，溶解后再加入
95%
乙
醇是浓度达到
70%
。
100ml
A
液
=5ml
0.4%
阿尔新蓝
+70ml
95%
乙醇
+5ml 1M
MgCl
2
+20ml
dH
2
O
。
B
液：
0.5% alizarin
red S, 0.5g alizarin red S
粉末溶解于
100ml
蒸馏水中。
混合液中试剂终浓度：
0.02% alcian
blue
，
40-60 mM MgCl
2
,70%
乙醇。
在使用前，取
10ul
的
B
液和
1ml
的
A
液混合使用（现配
现用）。
3
、斑马鱼整体软骨
-
骨骼无酸双染色
取各处理组幼鱼，分装于
1.5 ml
离心管中，每管约
50
只幼鱼。
1
）幼鱼组织固定
< br>麻醉幼鱼，使用
4%
的中性甲醛缓冲液（由
PBS
配制）或使用
2%PFA
固
定在
1.5ml
离心管中，室温
振荡
10min
，放置
2h
。吸走固定液，并用
PBS
清
洗
2
次，使用
50%
乙醇脱水。
2
）染色
去
除
50%
乙醇，
加入
< br>1ml
阿尔新蓝
-
茜素红
S
染色液到离心管中，
质问轻
微振荡过夜。
3
）漂白
漂
白以去掉幼鱼表面色素。
漂白液现配现用，
由等量的
3% H
2
O
2
和
2%KOH
混合组成，终浓度为
1.5%H
2
O
2
和
1%KOH
溶液。染色管中，在去掉染色
液后，加入
1ml
水，倒置混合吸去液体。
再新加入
1ml
漂白液，并将离
心管盖
打开，室温放置
20min
。
4
）清理
去
掉漂白液，加入
20%
甘油
/0.25
KOH
室温振荡
30min
至
10h
，边振荡边
观察胚胎清理状态。然后用<
/p>
50%
甘油
/0.25%KOH
替换之前的清理液，并
再次室温振荡
2h
，放置过夜，显微镜下观察。
5
）保存和统计拍照
染色后幼鱼可在
50%
甘油
/
0.1%KOH
溶液中
4
°长期保存备
用。并在此保
存液中利用解剖镜和成像系统拍照。
4
、阿尔新蓝软骨染色
1
）幼鱼组织固定
< br>麻醉幼鱼，使用
1.5ml
离心管，固定在静置了两天的
4%PFA
溶液中，室
温过夜。
2
）阿尔新蓝染色
吸去
PFA
后，用
95%
乙醇溶液洗胚胎
2
次，彻底
吸干后，添加
1ml80%
乙醇
/20
%
冰醋酸配制的
0.1%
的阿尔新蓝溶
液，取上清染液，染色过夜。
3
）洗脱
用
60%
乙醇
/40%PBS
溶液冲洗胚胎
1
次后，换成
40%
乙醇
/60%PBS
再冲
洗
1
次，再更换成
20%
乙醇
/80%PBS
冲洗一次，
最后用
PBS
缓冲液冲洗
2
次。
4
）清理
吸
干
PBS
溶液后，使用溶解于饱和四硼酸钠溶液中的
0.05%trypsin
清理
胚胎
1-3h
。
5
）漂白
吸
去胚胎周围的清理液并用
PBS
冲洗
1
次，然后添加
1%KOH/3%
H<
/p>
2
O
2
溶液侵泡
2-4
小时。
打开离心管盖
30
°左右静置，
并观察胚胎的清理状态。
6
）脱色
过
1%KOH/3# H
2
O
2
：甘油梯度溶液。
现用
1:3
比例，再换成
1:1
，最后换
成
3:1
（
1%KOH/3# H
2
O
2
：甘油）
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