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环境毒理学实验
姓名
:
吴天真
班级：生物
1501
学号：
201547005
联系方式：
队友：高秋远
梁旭
实验一污染物对藻类的生长抑制作用
一、实验目的
1.
了解藻类的生长规律；
2.
掌握藻类的培养方法；
3.
掌握化学物质对单细胞绿藻生长影响的评价方法。
二、实验内容
1.
运用毒理学实验方法，观察藻类在含有化学污染物的水环境中的生长抑制情
况；
2.
求出受试化合物对藻类生长抑
制的
EC50
；
3.
阐明受试化合物的剂量－效应关系与生长抑制特征。
三、实验原理
单细胞藻类个体小、<
/p>
世代时间短，
是水体中的初级生产者。
因
为可在短期内
获得化学物质对其许多世代及种群水平上的影响，
所以利用污染物对藻类生长的
抑制作用，
能反映污染物水平对水
体中的初级生产者的作用情况。
通过将不同浓
度的受试物加到属
于对数生长期的藻类中，
在规定的实验条件下继续培养，
每隔<
/p>
24 h
测定藻类种群的浓度或生物量，以观察受试物对藻类生
长的抑制作用。经
方差分析或
t
检验，
显著低于对照
(p
<
0.05)
的生长率表明藻类生长
受到抑制。
四、实验仪器和试剂
1.
受试物
研究藻类生长抑制实验的受试物应当是挥发性低、
环境稳定性好且可溶于水
的物质。如果需要助溶剂，它在水中的浓度不能超过
0.1
mL/L
。
2.
藻种
斜
生<
/p>
栅
藻
(Scenedesmus
obliquus)
或
蛋
白
核
小
球
藻
(Chlorella
pyrenoidosa)
。
3.
培养基
藻类的培养基很多，
其成分和浓度各不相同，
小球藻和栅藻可
用
“水生
4
号”
培养基培养。
配制培养基时可将营养盐类按所需浓度直接加入无菌蒸馏水或去离
子水中。
应按顺序逐个加入，
待一种盐类完
全溶解后再加另一种。
亦可先配制各
种营养盐类的浓度储液，<
/p>
经灭菌后避光冷藏保存。
当需要配制营养基时，
< br>将一定
量的浓储备液摇匀，依次加入到蒸馏水或去离子水中即可。
*
取少量菜园土，加
2-3
倍自来水，煮沸
10
余分钟，冷却后用滤纸过滤即
可使用。
4.
实验器材
电子天平
(2
台
)
、
立式压力蒸汽灭菌器
(2 <
/p>
台
)
、
无菌操作
台
(4
台
)
、
显微镜
(4
台
)
、生化培养箱
(2
台
)
、
pH
计
(4
套
)
、气浴恒温摇床
(4
台
)
、可见分光光
度计
(4
台
)
、数字照度计
(2
台
)
、血球计
(4
套
)
、血小球记数板
(200
块
)
、
4
到
7
只
30W
的普通白色荧光灯、
ф
60
漏斗
(4
个
)
、锥形瓶、温度计、滤纸和纱布
等若干。
5.
实验药品
硫酸铵、磷酸二氢钙、碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、氯化铁均为分析纯，土
壤
浸出液。
五、实验步骤
1.
藻类培养
培养温度为：
24
±
2
℃；
白色荧光灯均匀光照，
光照强度为
4000
±
400
l
ux
，
连续光照或以
12
：
12
或
14
：
10
光暗比光照；机械震荡
(100
±
10
次
/min)
；培
养容器用棉塞、
滤纸、
纱布
(2-3
层
)
或
锡箔纸等封闭，
对挥发性化学物质采用磨
口玻璃瓶塞完全封闭。
可根据实验需要选择容量不同的实验容器，
125 mL
锥形
瓶中测试液的体积为
40-60
mL
；
250
mL
锥形瓶中测试液体积为
70-100
mL
；
500
mL
锥形瓶中测试液的体积为
100-150
mL
。
2.
藻试液的配制
从储备液中取出一定的
藻液，接种到新鲜的无菌培养液中，接种浓度约为
105 <
/p>
个
/mL
。在与试验要求相同的条件下进
行预培养，要求在
2-3
天内藻类能达
到对数生长，然后再次转移到新鲜的培养液中。如此反复转接培养
2-3
次，藻
类生长健壮并开始处于对数生长期时即可用来制备实验中需要的藻类
试验液。
3.
受试物试验液的配制
根据初步试验确
定产生效应的浓度范围，
至少设置五个构成对数间距系列的
浓度
，浓度比不超过
2.2
。较佳的浓度范围为，最低测定的浓度必
须对藻类生长
影响较小
(
如生长抑制率
<10%)
，最高测定浓度对藻类生长的抑制率接近
100%
。
至少设置
3<
/p>
个平行样，每一系列设一个对照。实验前应测定受试液的
pH
，必要
时用盐酸或氢氧化钠溶液将
pH
调到
7.5
±
0.
2
。
试验结束时应测定被测物质的实
际
浓度。
4.
测试液的配制
先在每个试验锥形瓶中加入
10
mL
藻液，再加
10
mL
受试物溶液。对照组只
加
10 mL
培养液。
将各瓶摇动混匀
后，放入光照培养箱中培养。实验开始后，每隔
24h(
即在<
/p>
24
，
48h)
测定各组藻类的细胞密度。
六、实验结果
1.
藻类生长的测定
藻类生长是指在试验
期间每毫升溶液中藻类细胞数目的增加量。
一般用以下
三种方法
测定藻类的生长：①细胞计数；②测光密度；③测叶绿素含量。推荐使
用方法①和②。<
/p>
2.
数据处理
将不同浓度试验培养液和对
照培养液的藻细胞浓度与测试时间绘制成曲线
图，再用下面方法确定浓度效应关系。
生长率是单位时间内
(tn-t1)
藻类细胞增长的量
(Nn-Nt)
。
对数生长期的藻类
平均特定生长率可用下式计算：
（
1
）式中：
μ
——藻类平均生长率；
t
——培养时间，
t1
为
起始时间，
tn
为终了时间；
N
——藻类细胞生长量，
N1
为起始细胞数，
Nn
为最终细胞数。
< br>
以不同浓度组中藻类生长率的下降比例与对数浓度作图，
可直接从图上读出
EC50
，再标明测定时间，如
24 h EC50
。也可求出回归关系式，再算出
EC50
。
表
2
实验记录表格
根据直线内插法或概率单位图解法估算
24
h
、
48
h
和
72
h
藻类生长受到抑
制的
EC50
。
测得的实验数据如下：
24h时
48h时
0
20
5
0
80
110
0
20
50
80
110
0
4313.6
2745.3
1272.6
627.63
440.88
28943
9897.9
1840.3
584.63
177.88
荧光强度
3094.5
2858.5
904.38
691.38
602.13
40968
12712
710
458.25
16
0.13
3784
2564.9
994
.88
845.5
477
20402<
/p>
10786
1881.9
717.5
85.25
平均值
3730.7
2722.9
1057.287
721.5033
506.67
30104.33
111
31.97
1477.4
586.7933
141.0867
生物量
2.22322
< br>1.61854
0.619172
0.417702
0.288802
18.0474
6.66
398
0.87124
0.336876
0.069452
时间
浓度
72h时
20
50
80
110
18798
8985.3
100
3.5
131.63
37.75
138
44
18346
1265.6
65.7
5
35
16255
7330.9
663.38
203.63
11.625
16299
11554.07
977.49
33
133.67
28.125
9.7
642
6.91724
0.571296
0.065002
0.001675
生物量单位：
10^5
个
/mL <
/p>
时间
24
48
7
2
受试物浓度
0
20
< br>50
80
生物量
2.22322
1.61854
0.619172
0.
417702
生长率
0.054574
0.041348
0.001311
-0.01509
生物量
18.0474
6.66398
0.87124
0.336876
生长率
0.087252
0.058966
0.01
4231
-0.00896
生物量
9.
7642
6.91724
0.571296
0.065002
生长率
-0.02559
0.001554
-0.01758
-0.06855
110
0.288802
-0.030
47
0.069452
-0.05938
0.001675
-0.1552
根据直线内插法或概率单位图解法估算
24
h
、
48
h
和
72
h
藻类生长受到抑
制的
EC50:
24h EC50=3.35 48h EC50=3.39
72h EC50=3.47
七、注意事项
1.
在正式试验前必须进行必要的预试验。
2.
实验藻种的选择和预培养应注意：藻细胞大小均匀，颜色
鲜绿，处于对
数生长期。试
验开始<
/p>
3
天内，对照组藻细胞浓度至少应增加
1
6
倍。
3.
需要明确受试化合物的理化特性，有针对性的进行实验。
八、讨论与思考
1.
干扰藻类
EC50
正常测定的因素有哪些？
（
1
）各锥形瓶在培养
箱内的位置不同，受光程度不同，导致藻类生长情况
受影响。
（
2
）在藻类培养过程中，部分藻类沉
淀，影响受光
（
3
< br>）测定吸光度时，藻液未混合均匀，导致测得的数据与实际不符、
2.
受试物质对藻类的生长在不同时期起的作用有何不同？有无促进作用？<
/p>
随着时间增加，高浓度抑制作用加强，低浓度促进作用加强。
3.
根据实验结果，提示进一步开展哪方面的研究？
可进行以下几个方面的研究：
（
1
）
探究受试物影响藻类生长的具体原因；
（
2
）
探究该受试物是否对其他植物有类似的左右；
（
3
）
实验成果的具体应用。
实验二
污染物对发光细菌的急性毒性测试
发光菌毒性测试是
20
世纪
70
年代后兴起的一种微生物监
测环境污染及
检测污染物毒性的新方法。
1978
年美国
Beckman
公司即推出
功能完备的生物发
光光度计“
Microtox
”
，自此，这一急性毒性测试技术在世界范围内迅速推广。
因此人们也将发光菌毒性测试称为
Microtox
测试
。采用现代光电检测手段
(
生
物发光光
度计
)
的发光菌生物毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。
该方法
快速、简便、灵敏、廉价
,
在有毒物质的筛选，环境污染生物学评价等方面有重
要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。
1995
年
3
月，国家环境保护局、
国家技术监督局将发光菌毒性测试定为水质监测标准方法
(GB/T
15441-1995)
。
一、实验目的
1.
掌握发光细菌毒性测试的标准方法；
2.
根据发光细菌发光强度的变化判断受试化合物的毒性；
3.
初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。
二、实验内容
1.
发光细菌的复苏；
2.
发光细菌发光强度的测定；
3.
受试化合物毒性的计算。
三
、
实验原理
发光细菌是一种非致病性的普通细菌，
具有发光能力，
在正常条件下经培养
后能发出肉眼可见的兰绿色光，
这种发光过程是细菌体内一种新陈代谢反应，
是
氧化呼吸链
上的一个侧支。发光细菌的发光反应模式图
(1)
所示。发光细
菌发光
反应途径可简单概述为：
FM
NH2
＋
O2
＋
RCHO
→荧光＋
FMN
＋
H2O+RCOOH (1)
这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能
被散发。当细菌体内合成萤光酶、
萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生化反应，
反应的结果便产生光。发
光菌的发光现象是其正常的代谢活动
,
在一定条件下发光强度是恒定的，
与外来
受试物
(
无机、有机毒物
,
抑菌、杀菌物等
)
接触后
,
其发光强度即有所改变。<
/p>
变化的大小与受试物的浓度呈相关关系
,
同时与该物质的毒性大小有关。
通常认
为外来受试物通过下面
两个途径抑制细菌发光
: (1)
直接抑制参与发光反应的
酶类活性
;
(2)
抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程
(
如细胞呼吸等
)
。
毒物的
毒性可以用
EC50
表示
,
即发光菌发光强度降低
50%
时毒物
的浓度。
实验结果显
示
,
毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。
因而可以根据发光菌发光强度
判断毒物毒性大小
,
用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。
图
(1)
发光细菌的发光反应模式。
E1:
细
菌荧光素酶，
由
α
、
< br>β
2
个亚基
组成，
α
为
40000-4
2000D
，
β
为
37000-39000D
。单独
α
、
β
亚
基均无发光活
性，
只有
α
、
β
共存时才有活性。
E2:
NADH
：
FMN
< br>氧化还原酶，
分子量为
3000D
，