-
眼脉络膜黑色素瘤
OCM-1
细胞的机制
【摘要】
【目的】
研究
-
70
℃反复冻融体外杀伤人眼脉络膜黑
色素瘤细胞系
OCM-1
的机制。
【方法】
OCM-1
细胞反复冻融后
,
用噻唑蓝比色法
及克隆形成实验检测细胞的杀伤情况和细胞生长活力
,
免疫组织化学方法检测细
胞
P16
表达
的变化
,
电镜及共聚焦显微镜观察冻融后细胞凋亡和坏死的形态
学改
变
,
并测定细胞的凋亡比率
,
流式细胞仪检测冻融前后细胞
CD40
表达比率及细胞
膜电位的变化。
【结果】<
/p>
噻唑蓝比色法检测及克隆形成实验显示
,
冻融可以直接
杀伤
OCM-1
细胞
,
且残存的细胞生长能力也明显受抑制。
免疫细胞化学染色见对
照组的细胞呈
P16
阳性
,
而冻融后的细胞均呈阴性
,
冻融后培养的细胞部分呈阳
性。
电镜下
观察到冰晶的结构特征及细胞的坏死和凋亡等变化。
激光共聚焦显微
镜观察发现凋亡细胞随着冻融次数的增加而增多。
流式细胞仪测定显示冻融后细
胞膜电位下降
,
冻融前后
CD40
阳性细胞比率差异明显
,
且呈一定的量效关系。
【结论】冻融不仅可以明显杀伤
OC
M-1
瘤细胞
,
还能抑制残存瘤细胞生
长。反复
冻融能诱导大量的肿瘤细胞发生凋亡
,
此为杀伤肿瘤及诱导肿瘤退变的直接原
因
,
其机制与线粒体膜电位及
P16
表达下调有关。
冻融后瘤细胞坏死因子
CD40
表达增强
,
可能是增强机体的免疫应答
,
介导
机体免疫杀伤瘤细胞的机理。
【关键词】
反复冻融
;
脉络膜黑色素瘤
;
细胞凋亡
; CD40;
线粒体
膜电位
A
bstract:
【
Objective
】
To
investigate
the
mechanism
of
repeating
-
70 ℃
freeze thawing on human choroidal melanoma cell
line OCM
-1.
【
Meth
ods
】
OCM-1 cells were frozen
by repeating -
70 ℃ freeze thawing
for various frequency,
then
the death
rate of cells were
examined
by MTT
essay.
The
cell
viability
was
measured
by
clone
essay.
The
morphological
changes
of
the
cells were
observed
using
electron
microscope
and
the
P16
immunocytochemistry staining was
performed. The cell apoptosis rate of
the
OCM-1
cells
was
examined
by
laser-scanning
confocal
microscopy
(LSCM).
The cell CD40 positive rates and
mitochondrial membrane potential (MMP)
were observed by flow cytometry (FCM).<
/p>
【
Results
】
Growth of OCM-1 cells
was
inhibited
by
repeating
-
70
℃
freeze
thawing.
And
that
showed
freeze
frequency dependent
effects (P50
为一个克隆
,
计算克隆形成率。
免疫细胞化学染色
细胞经
冻融处理后
,
收集细胞
,PBS
洗涤
,
吹散
,
用微量加样枪滴片
,
风干
,
甲醇固定。
3%H2O2
封闭内
源性过氧化物酶
10
min,
加血清并水浴
10 min,
加入一
抗
P16
后
,
依次加入二抗
,S-P/HRP
复合物
,
上述步骤均以
PBS
缓冲液稍洗
3
次
,DA
B
显色,Maye′s 苏木素复染细胞核
,
< br>常规脱水、透明、封片。显微镜下观察。
透射电镜观察
<
/p>
细胞冻融处理后
,
收集细胞
(
细胞数量≥1
×
107 个
/mL)
。加入
PBS,
1
000 r /min
离心
10
min(r=12 cm),
弃上清。放入预冷的
2%
多聚甲醛
2
戊二醛前
固
定液
( pH
值为
)
中,4 ℃固定
2 h,
再次离心后
弃上清。制作电镜切片
,
在透
射电镜下
观察及拍照。
激光共聚焦显微镜观察
细胞经
冻融处理后
,
收集细胞
,PBS
洗涤
,
吹散
,
用微量加样枪滴片
,
风干
,
甲醇固定。水洗
3
min,
用
Hoechst
33342
染色
5
< br>min,
晾干
,
甘油封片。共聚
焦显
微镜下观察。
流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的改变
<
/p>
细胞冻融处理后
,
收集细胞
(
细胞数量≥1
×
10
6)。洗涤
2
次
,
加入荧光
染料
Rhodamine
123
至终浓度
5
μ
mol/L,
于
37 ℃、
5%CO2
培养箱中负载细胞
30
min
后
,
再次洗涤
2
次
,
在流式细胞仪下
,
待荧光强度稳定后
,
每隔
30
s
计数
10 <
/p>
000
个细胞
,
连续
5
次。荧光强度高低代表细胞线粒体膜电位大小。
流式
细胞仪测定
CD40
比率
<
/p>
细胞按上述方法冷冻后
,
收集细胞
(
细胞数量≥1 ×
106),每管加入
100
μ
L
含
15%
多聚甲醛的
PBS,4 ℃固定
15 min,
离心
,
弃固定液。加入含
10%FCS
的
PBS
4
℃封闭
2
h,
洗涤
3
次后
,
每管加入
5
?
滋
< br>g/mL
的
CD40
单抗各
100
?
滋
L,
4
℃
孵育
1
h,
再次洗涤
3
次
,
于每孔中加入
1 ∶ 1 000
稀释的
FITC
羊抗鼠
IgG
作为
荧光二抗,4 ℃作用
h
后取出
,
充分洗涤
3
次后
,
并设空白对照管
,
使用流式细胞
仪检测
,
并分析数据。
统计学分析方法
<
/p>
实验的数据均使用
x±s
表示
,SPSS
软件对数据进行统计学分析。
2
结
果
细胞的杀伤比率
随着冻
融次数增多
,
杀伤比率明显增加
(
表
1)
。
克隆形成实验结果
对照组
细胞克隆形成较为均匀
,
克隆率为%
±
%。冻融后
,
细胞的贴壁能
力及生长能力明显减弱。
克隆形成较小
,
数目较少
,
并随着
冻融次数的增加克隆形
成的量进一步下降
(
表
1)
。
免疫细胞化学染色结果
对照组
细胞
P16
阳性
(
图
1A),
而冷冻后的细胞均呈阴性
(
图
1B),
冷冻后
培养的细胞部分呈阳性
(
图
1
C)
。
电镜观察结果
对照组
结构完整
,
细胞为不规则圆形或多角形
,
胞浆丰富
,
胞质均匀
,
胞
质内有丰富的线粒体、粗面内质、核糖体、高尔基
器、溶酶体和微丝
;
核膜清晰
,
核大
,
核仁明显
,<
/p>
能见到核分裂。
冻融后的细胞内发现梭形
,
边界清晰
,
低密度的裂
隙
,
为早期冰晶的超微结构
(
图
2A)
。
镜下见大量不同时期的凋亡细胞及典型的凋
亡小体
(
图
2B)
。
坏死的细胞密
度降低
,
细胞膜破裂
,
消失
,
细胞成分外溢
,
染色质、
胞质均溶解
;
有的细胞仅余核仁和完整的核膜
,
其他细胞成分均消失。
共聚焦显微镜观察细胞形态变化
对照组细胞
Hoechst 33342
染色见细胞核蓝色
,
规则圆形
,
大小均一
(
图
3A
)
。
冻融处理的细胞
,
镜下可见凋亡细胞的细胞核固缩而被
Hoechst
33342
染成
亮蓝白色。不同冻融次数出现的凋亡细胞比率差
异明显
(
表
1)
。×3
组出现凋亡
细胞为最多
(
图
3B)
。
坏死的
细胞
,
细胞膜消失
,
< br>细胞内容物逸出
,
核内容物脱出呈
带尾的丝状或礼花状
(
图
3C)
。
凋亡细胞随着冻融次数的增加而增多
,<
/p>
达到一定程
度后随着坏死细胞的增加反而减少。
< br>
流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的改变
<
/p>
冻融作用后
,OCM-1
细胞线粒体的膜
电位下降
,
增加冻融次数
,
下降程度
更加明显
(
表<
/p>
1)
。
流式细胞仪测定细胞
CD40
的阳性比率
对照组的
OCM-1
细胞也有%
±
%的细胞表达
CD40,
随冻融次数增加
,CD40
表达率上升
(
表
1)
。
3
讨
论
<
/p>
冷冻治疗后
,
细胞内冰晶形成杀伤肿瘤<
/p>
Gage
等认为细胞内冰晶形成和冰晶的机械损伤是最重要的
机制
:
细胞
外液凝固结晶使细胞处于相
对的高渗状态
,
致使细胞脱水和皱缩
,
而细胞外间隙
形成的高渗状态使得冰晶容易通过细胞膜的微孔进
入细胞
,
促使细胞内冰晶的形
成
,
细胞膜的完整性被破坏。最后细胞内高度浓缩的电解质破坏细胞使之
坏死、
溶解。但是
,
此前的研究并没有
发现冰晶的超微结构特征。本研究在电镜下发现
早期冰晶形成的结构特征
,
直接证明了冻融通过形成细胞内冰晶杀伤肿瘤细胞
,
细胞外冰晶形成可以使细胞脱水、皱缩
;
而细胞内冰晶的形成则使细胞坏死、死
亡。
反复冻融诱发
OCM-1
细胞发生凋亡及其机制