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Western-Blot
操作流程
试剂配制
蛋白提取试剂
1.
RIP
脾解液
:
10mM Tris (,)
1%NP40
%TritonX-100
%
兑氧胆酸钠
2 mM EDTA
1 mM PMSF
20%T
油
调
pH
直至。
混匀后
4C
保存，长期保存于
-20 C
。使用时，加入蛋白酶抑制剂
cooktail
工作液
制胶用
(
1-6):
1.
L Tris ? HCl
()
Tris 12.114g
蒸储水
100ml
溶解后，
(
用浓盐酸调
pHS),
室温下保存。
2.
L Tris ? HCl
()
Tris 18.671g
蒸储水
100ml
溶解后，
(
用浓盐酸调
pHS),
室温下保存。
3.
10% SDS
SDS
10g
蒸储水至
100ml
如溶解困难，可在
50C
水浴下溶解，室温
保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
4.
10%
过硫酸胺
(
AP)
过硫酸胺
蒸储水
1ml
（现用现配，可先将过硫酸胺
干粉称好分量后放在管中，一次性多装几管，使用时加入蒸储水
水即可，溶解后
，
4C
保存，保存时
间为
1
周）
5.
四甲基乙二胺原液
（
TEMED
4C
保存。
6.
< br>30
灿稀酰胺
:
4?C
保存。
10
层胶，即分离胶
（两块胶，
15ml
）
：
胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定
依次加入
去离子水
30
炳烯酰胺
5ml
1.5M Tris-HCl
()
10%SDS
10%AP
TEMED
150
l
150
l
6
卬
卬
(
1
l
每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，
可以将过硫酸胺和
适当调整，加入<
/p>
TEME
混匀后应即刻灌
胶。
5
毗层胶（两块胶，
6
ml
）
:
依次加入
去离子水
30%M
烯酰胺
1M Tris-HCl ()
10%SDS
10%AP
TEMED
；
加大，根据实验当时的温
度
灌胶后加异丙醇（
1ml
）消泡
1ml
60
60
6
卬
l
卬
l
TEMED
(
1
l
每加一种成分随即摇匀，
为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和
T
EMED;
加大，根据实验当时的温度
适当调整，加入
TEME
混匀后应即刻灌胶。
7.
5X
电泳液缓冲液
Tris
（）
甘氨酸
0
SDS
15.1g
94g
5.00g
蒸储水至
1000ml
溶解后室温保
存，用时稀释
5
倍，通常取
160ml
配制成
800ml
即可。
8.
10X
专膜缓冲液
甘氨酸
()
蒸储水
1ml
Tris ()
30.3g