-
用微卫星序列和线粒体
DNA
分析北美山猫种群
区域结构
摘要
分析物种遗传多样性有利于广泛分布的野生动物物种保护。北美山猫（
Lynx r
ufus
）是广泛分
布的猫科动物，其保护管理以州为单位进行
。目前对其广泛分布范围内的遗传多样性知之甚少。
本文检测了北美大陆分布范围内山猫
的
10
个微卫星位点和线粒体控制区序列，
分析了该物种的分
化格局：
两种标记都支持西部种群与中西
部
/
东部种群在地质时期都曾经历了种群扩散，
且中西部
/
东部种群的栖息范围经历了周期性的扩散<
/p>
-
缩小变化；三个群体间存在明显分化，说明近期出现
的障碍阻隔了群体间的基因流。结果警示：人口增长破坏了山猫赖以生存和加强基因流动的森林
环境，同时并提醒人们在大山猫分布范围内形成各州之间统一的保护管理方案，以保护其历史
和
现有遗传多样性。
关键词
Lynx rufus
微卫星
DNA
线粒体
DNA
遗传多样性
基因流
种群结构
北美洲
简介
遗传变异与分化格局是由历史和当代原因共同作用于进化因素形成，包括遗传漂变、基因
流
和自然选择。包括生存范围扩张和缩小、大范围自然景观变化在内的历史事件起初影响
遗传分化
格局的形成。然而，现今的基因流情况、人类居所变化等因素也在影响物种的遗
传分化格局和种
群结构。
对分布广泛
、具有长距离迁徙能力、连续区域分布的物种进行遗传分析，可以帮助制定广泛
范围内的
统一保护措施。而实际情况是动物管理方案大都是由各个州、省划界而分别执行，但移
动
的物种并不遵循这些人为设定边界，因此此级别的管理方案并不合适，鉴于此，遗传分化研究
工作可帮助形成有效管理方案。对广布的、可迁徙物种的研究工作很多，但都集中于多种脊椎，
如海洋哺乳动物、陆生哺乳动物、鱼类和爬行动物。此类研究的目的是在清楚物种情况下有效管
其遗传变异和制定保护措施。
作为生态链中
顶级捕食者，某些猫科动物具有经济重要性和重要的生态学地位。
Schwartz
等
人研究了加拿大猞猁
Lynx cana
densis
的分布范围内的空间分化和种群内动力学，并检测了该物种
在其西部生活中心区向外部大数量迁移的基因流。为保持生态链中物种连续性，
Schwartz
等得出
结论，加拿大猞猁种群保护的保护国工
作需要际合作。而另一方面，来自芬兰和波罗的海沿岸国
家的欧亚猞猁种群的分子水平研
究表明，这两个种群存在明显的遗传差异，需要分别管理。此外
有研究表明，由于亚马逊
河和达瑞恩海峡的阻碍，在美洲豹物种内基因流动受到限制，因此形成
可观的遗传分化。
北美山猫是独居、具有高度迁移性、多配偶生活的肉食猫科动
物，广泛分布与北美大陆，包
括美国大部分地区、
加拿和墨西哥
部分地区。
在北美山猫分布范围内，
有
12
个亚种。
亚种分类依
据主要是皮毛
颜色和颅骨的多变解剖形态。北美山猫可适应多种生境，但都需要森林覆盖，以供
迁移及
各种活动所需。
北美山猫被认为是被毛游戏性动物，由各州、
省分别制定的野生动物保护措施管理。过去几
十年内，
美国一些
州的山猫数量有所增加，
并且现在数量上长势头不减。
其中
39
个州内允许捕猎
山猫，其他州由于山猫
数量相对稀少而禁止猎杀，尤其在中西部地区，由于土地大面积用于耕作
而使环境不适于
山猫生存。在加拿大北部地区山猫数量有限，北部土著人生活的
8
个省份中有其
个省份允许围猎山猫，
而在西部和大西洋沿岸省
份山猫则比较常见。
由于数量下降，
，
魁北克省自
1991
年以来一直禁止猎杀山猫，并且发现山猫数
量稳中有升。在墨西哥，有
5
个省份允许猎杀山
猫，但并未发现墨西哥中部和南部山猫的数量减少。
由于较强迁移能力、广泛分布性、国际经济重要性和在北美生态系统中作为顶级捕食者的重
要作用，山猫可以作为模式生物，来寻找与遗传多样性、种群分化和保护措施相关的问题。由于
山猫并不遵循人为划定的行政州、省边界，因而基于遗传多样性和群体分化而制定的保护措施，
比现行的保护政策更为合理。
长距离迁徙能力使山猫的基因流动性比较大
，
分化程度较低。
然而，
有研究表明由
于自然阻隔和人为障碍的存在，基因流只发生在小范围内。了解最大范围内的种群
情况，
才能发现山猫历史分化和现有种群格局的关联性，以最大程度保存该物种遗传多样性，以
供繁盛繁衍和适应环境的所需。
曾有研究评估小范围内的山猫
种群遗传结构，而所有种群分布范围内的种群遗传结构、以及
其与现有保护政策的相关性
，尚无人作相关研究。本文中用用微卫星序列和线粒体
DNA
来
分析
历史种群事件和现有种群隔离如何影响北美山猫的遗传多样性和种群分化。本文研究
的意义在于
为广泛分布物种的保护措施提供参考。
方法
采样与
DNA
提取
1995
年
-2006
年间采集了
58
7
个野生山猫组织样本，包括耳、舌、肝组织。组织样本来源于
各州省大学、科研机构以及个人的野生动物研究工作。室温样本保存、加
20%
的二甲基亚砜溶液
中，用氯化钠浸泡直到提取
D
NA
。肝组织样本来源于解剖实验，
-70
℃
冻存。组织样
DNA
提取试
用
DNeasy tissue
kit
。
样本采集地包括美国的
16
个州和加拿大的
2
个省：
Arkansas (AR)
、
California(CA)
、
Florida
(FL)
、
Illinois
(IL)
、
Indiana (IN
)
、
Kentucky(KY)
、
Louisiana
(LA)
、
Maine
(ME)
、
Michigan [UP
和
LP]
、
Minnesota(MN
)
、
Missouri
(MO)
、
New Brunswick
(NB)
、
North
Dakota(ND)
、
Nova Scotia
(NS)
、
Nevada
(NV)
、
Texas
(TX)
、
Wisconsin
(WI)
和
Wyoming (WY)
。来自
Michigan
州的样本被分为
UP
和
LP
，
由于河流将该地区分割为上下半岛，
并且因为早期研究证明两个地点来源的采样存在显
著
分化。因此，所采集的样本分为
19
个群体，代表早先分类中
12
个亚种中的
8
个亚种。有些样本
提供了县级水平的采样地信息，而由于采
样方法的原因，某些样本只能提供州、省级级别的采样
地信息。由于山猫的保护管理是由
州、省级部门进行，故对采样命名也以州省边界分别、取各个
州省名缩写字母代表。
标记使用与分析
本文使用微卫星序列和线粒体
DNA
两种方法进行研究。
所用
10
个微卫星座位已被用于其他
种的猫科动物
PCR
反应中。
其中六对引物的设计最初用于家猫研究
（
FCA023
、
FCA043
、
FCA045
、
FCA077
、<
/p>
FCA090
、
FCA096
）
，三对引物的设计用于加拿大猞猁研究
(LC1
09
、
LC110
、
< br>LC111)
，
一对引物最初用来研究北美山猫。
PCR
反应参数，参见
Croteau
所用的针对所有微卫星序列
PCR
反应参数。
PCR
产物用含去离子甲酰胺、
蓝色葡聚糖的
EDTA
上样缓冲液按
1:1
稀释，
用
36
cm
长度
5%
浓度变性胶分离，
2500scan/h
条件下，跑胶
2.5<
/p>
小时。凝胶图像用
Genescan3.1.2
< br>扫描，
Genotyper
2.5
用于等位基因分型，重复
3
次，以保证没有分型错误。用<
/p>
MICROCHECKER2.3.3
检测无效等
位
基
因
位
点
。
本
文
用
PCR
方
法
扩
增
线
粒
体<
/p>
DNA
控
制
区<
/p>
基
因
，
所
用
两
引
物
为
CatPro5
’
-C
AAGGAAGAAGCAACAGC-3
’
和
Cat12S5
’
-TRRAGGGCATTTTCA
CCG-3
’
，
引物曾用于
家猫线粒体
DNA
研究，锚定位点为环状线立体<
/p>
DNA
的
16249
位和
1018
位，扩增长度近为
1
742
个碱基。由于时间和技术原因，从
587
个样本中选取一部分用于
DNA
测序。从每个群体中选
取
一部分样本以保证每个地区都能被有效代表。但是由于测序分辨率原因，某些选样容量
被高估，
低于期望值。
PCR
反应体积
为
50
μ
l
，
用
2
倍浓度的
Thermoprime ABGene
的
PCR
混合液，
0.5
μ
mol<
/p>
引物和
30-50ngDNA
模板。
反应条件包括变性温度
94
℃
2min
，
35
次循环步骤
为
94
℃
1min
，
60
℃
1min
，
72
℃
1min
，延伸反应
72
℃
5mi
n
。产物纯化用
QIA-quick
PCR
纯化试剂盒。设计三个引物用于该区
域内的
HVS-1
序列和保守序列，上游引物为
LruFw
d3 5
’
-CACTATCAGCACCCAAAG
C-3
’
，锚定在家猫线粒体
DNA
该区域
16,269
位
点，本反应中锚定于环状线粒体
DNA
的
3
位点，
下游引物为
LruRev2
5
’
-GACCCCGCATAGAGAATAAG-3
’
，锚定在家猫的
160
位点，本反应中锚
定于环状线粒体
DNA
< br>的
882
位点。中间引物为
Lr
uRevSeq 5
’
-AGGATTGCTGGTTTCTC
G-3
’
锚定
在家猫线粒体
DNA
该区域
16,862
位点，本反应中锚定于环状线粒体
DNA
的
< br>574
位点。引物对
共扩增
81
3bp
碱基对。循环测序反应为
Eppendorf Mast
ercycler
，参数为变性温度
96
℃
4min
，
99
< br>次
循环步骤
96
℃
30s
，
50
℃
15s
，
60
℃
4min
。用
SephadexG-50
柱分离扩增片段，
36cm
长度
5%
变性凝
胶，
1,200
scans/h
跑胶
7
小时，用
ABI377automated
sequencer
读取序列信号。凝胶图像用
Genescan3.1.2
分析。
DNA
序列信息检测和比对工作用
< br>SEQUENCHER4.7
完成。
< br>该扩增序列中含有串联重复区，其区域大小、变异位点数目和重复度存在变化。由于对重复
序列的比对存在不确定性，只重复序列两侧非
464bp
的重复序列可用于比对分析。因为扩增反应
不佳，或者由于测序分辨率不高，某些个体
样被再次测序并重新进行序列比对，因此近
50%
的样
本被重新测序以保证正确的序列比对结果。
分析遗传多样性
根据微卫星序列标记
结构数据检测群体当前遗传变异度。用
GENETIX4.05
计算观测杂合度
和估计杂合度，用
FSTAT
2.9.3.2
计算等位基因数目、等位基因相对丰度、等位基因频率。用
GENEPOP4.0
分析每个群体中
10
个位点的连锁非平衡
LD
值，用
GENEPOP4.0
检测群体偏离遗
传平衡
HWE
的显著值。
< br>用线粒体
DNA
控制区变异数据观测采样地群体历史遗传
多样性。
用
DnaSP4
分析序列变异
位
点数目、单倍型、碱基转换和颠换数目以及插入
-
缺失位点。用
ARLEQUIN 3.11
计算样
本采集地
单倍型变异性
h
、核苷酸变异
性
π
。
h
、<
/p>
π
值均被用于群体扩张、种群瓶颈、
HW
E
和采样地群体
混合度检测。单倍型差异矩阵用于各个扩增片段
之间的变异分析。
分析历史种群数量
用
NETWORK 4.5
构建“巢式
”系统树。选用这种系统树原因在于被研究测序的单倍型被接
在末端，而中间连接枝代表
已经消失的、或为仍存在的原始单倍型，此种系统树更能准确描述单
倍型之间的亲缘关系
。
几个统计数据用于历史种群数量的的扩大、减缩或平衡分析
。扩张速率
S/d
用于区分种群数
量分
析扩张和平衡，
该值大则说明近期发生了种群扩张，
值小则说明
种群数量处于长期稳定状态。
Fst
值、
D*
值和
F*
值都被用来测算历史种
群数量变化。较高的
Fst
值和较低的
D*
值与
F*
值，说
< br>明种群处于扩张状态；而相反则说明，种群变化是由于自然选在的作用。核酸比对错配分布以及
< p>rg
值用于区分种群扩张和碱基漂变平衡。
分析群体结构
STRUCTURE2
.3.1
分析现有群体结构，推断采样群体的聚类簇数目
K
，并将各个群体归类到
相应聚类簇中。用
B
ayesian
聚类计算模型来在特定假设
K
< br>值下计算聚类“后可能性”
，并且寻找
最可能
K
值，模拟计算首先假设
HWE
< br>和连锁平衡条件。设定不同
K
值所产生的
?
K
，在
?
< br>K
最大
时，
K
< br>值能最好解释聚类簇数目。
种群现有群体结构分化分析
，
用
GENEPOP4.0
计算不偏倚
估计值比较群体间或聚类簇之间的
遗传分化系数
Fst
。
群体历史结构分化分析，
用
< br>AMOV
A
软件分析比对线粒体
DNA
分子控制区的
扩增序列，比较分子间差异，分析的群体变
异组成
Φ
st
值，以分析来自种群内不
和种群之间变异
度比例。采样地之间的地理距离
IBD
可用测量和
Fst
值推算两种方法得出。主坐标
分析可用于微
卫星序列位点分化的主成分析。
结果
遗传多样性
587
< br>个取样中，获得了
581
个样品多座位基因型，代表
17
个采样地。在近
4.4%
采样中未能
获得基因型信息。
所有的微卫星序列位点
都呈现等位基因多态性，
等位基因数目变化范围为
11-28<
/p>
，
平均每个座位
16
个等位基因；
观测杂合度变化范围为
0.53-0.79<
/p>
；
等位基因相对丰度平均值为
4.5
，
LP
和
ME
两地等位基因基因丰度最低，
对应两地最低观测杂合度，
而西部地区种群等位基因相对
丰都最高。在
170
对种群
-
位点偏离
HWE
的检测中，只有
IL
地区群
体的两个位点呈现显著值，
表现为纯合体频率轻度偏高。在对所有群体的
10
个位点的
45
对
LD
值检测中发现两个显著连锁
位点，在群体内
检测中，发现
IL
群体中有一个显著
L
D
值，
ND
群体中有三个显著
LD
值。所有
位点中都未发现无效等位基因。检
测各聚类簇内群体
LD
和
HWE
值。经检测未发现特殊位点呈
现显著
LD
值。显著偏离
HWE
的群体包括两个东部群
体，两个中西部群体和一个西部群体。
587
个样本中的
185
个样本用于
mtDNA
控制区序列测序，
代表
19
个采样地，
获得
38
< br>个单倍
型，
464
个比对序列的
35
个碱基位点为多态性
(7.3 %
)
，其中的
26
个为简并性位点。
35
个碱基位
点中，
31
个碱基发生碱基转换，
3
个碱基
位点发生颠换，
一个位点为插入缺失位点。
所有样本中，
h
是
0.817(
±
0.025)
和
π
是
0.0077
。单倍型间的平均核苷酸差异是
3.79
，变化范围为
2.44-7.56
。