-
B
ｒ
du
检测细胞增殖
实验
实验操作
:
1
．
铺细胞
,
每个
3
。<
/p>
5cm
di
ｓ
h
1
0
万个
,
在
3
７℃、
5
％Ｃ
O
2
孵箱中培养７
2h(
细胞密度至
5
０
－６
0%
左右
)
。
2
．
Ｂ
rdu(5
－溴—
2<
/p>
′－脱氧尿苷
)
加入培养细胞中
,1m
ｇ
/ml,
标记
48h
。
(
量
:Brdu
以铺满整个
di
ｓｈ底面为准。
)
3
．
固定<
/p>
:P
Ｂ
S
洗细胞
爬片
3
次
,
每
次
5
ｍ
in,
在摇床上晃动清洗
,4%
ＰＦ
A
固定
30mi
ｎ。
4
．
变性<
/p>
:
将固定好得细胞爬片用
PBS
洗
3
次
,
每次５
m
ｉ
n,2
ｍ
ol/L
得
H
Ｃ
l
在３
7
℃条件下变
性
5min,
可放置于
37
℃恒温孵箱
,
应用封口膜把培养皿封好。
(12
０
r
／ｍ
)
5
．
中与<
/p>
:0
。
1mo
ｌ
／
L
得硼酸钠
(PH8.3)
中与
10mi
ｎ
,PB
S
洗
3
次
,<
/p>
每次
5
ｍｉ
n<
/p>
、
(5
０
r
／ｍ
)
6
．
加入<
/p>
1ml
得
0
、２
%Trito
ｎ
X-1
０
0,10
ｍ
in
。
7
．
吸出Ｔ
ｒｉ
t
ｏ
nX-1
００
,
用
PBS
< br>洗
3
次
,
每次
5min
。
8
．
加入
1
ｍ
l
3
％得
BS
Ａ
封闭
,
室温
1h,
可在摇床上晃动、
9
．
吸出<
/p>
BSA,
用
P
Ｂ
Ｓ洗
3
次
,
每
次
5m
ｉ
n
。
10.
加一抗
(
尿嘧啶脱氧核苷
Brdu(
鼠单抗
)
1:200
),
用
1
％
BSA
稀释
,4
度过夜。
11.
将孵好一抗得细胞爬片用
PBS
洗
3
次
,
< br>每次１
0min
。
1
２
.
加二抗
(
羊抗鼠
IgG/
Ａ
le
ｘ
a
Ｆ
luor 594
1:
１
00
),
用
1%BSA
稀释
,
避光室温孵育
1
ｈ。
(
６
０
r/min)
１
3.<
/p>
将孵好二抗得细胞爬片用
PBS
洗３次<
/p>
,
每次
1
０
m
ｉ
n
。
14.
加Ｄ
API<
/p>
染细胞核
,
储存浓度为
< br>1mg/ml,
应将
D
ＡＰＩ完
全混匀
,
可用手弹几下
,
一般稀释比
例为
1:1
００
0(
用
PB
Ｓ
稀释
),
避光室温反应
1
０ｍ
i
ｎ。
1
５。将
D
ＡＰ
I
染好得细胞爬片用
PBS
洗
3
次
,
每
次１０
min
。
16.
中性树胶封片
,
荧光显微镜
观察
,20
０×镜下取
5
个视野
,
计数
Brdu
阳性细胞与蓝染得细胞
核数目
,
然后进行统计分析。
试剂配制
:
ａ、
Br
ｄ
ｕ得溶解
:
室温下
,
< br>将
250
ｍ
g
< br>粉末溶于２。
5ml
得
D
ＭＳ
O
中
,
储存浓度为
100mg
／
ml
分装
,
每管
1
２
0ul,
—２
0
℃保存。
b
。
2
m
ｏ
l/L H
Ｃｌ
< br>:
取８。
333mL
1
２
ｍｏ
l
／Ｌ
HCl
得浓ＨＣ
l,
< br>加入
D
Ｄ
W
定容至
50 mL
。
c.
0
。
1
mol/L
硼酸钠
:
称量
1
、９
07g
< br>硼砂
(N
ａ
2
< br>B
4
·
10H
< br>2
O 3
８１
.36 g/mo
l),
加入
DDW
定容
至
5
０
mL,
调Ｐ
H
＝
< br>8
。
3
、
ｄ
.
0.2%
Trit
ｏｎ
X
—
100
:
有
0
。５
%
得
T
ｒｉ
ton-100(2
。
5
ｍ
L
原液溶解于
4
７、
5<
/p>
mL
得
P
Ｂ
S
中
),
用
PBS
稀释至
0<
/p>
、２
%
。
e
。
3
％
B
Ｓ
A
:
称量１、５
g BSA,
溶解于
50
ｍ
L
得
PB
Ｓ中。
f
。
１％
B
Ｓ<
/p>
A
:
用
PB
Ｓ稀释
3
％
BSA
至１
%
。
g
、
４％<
/p>
FPS:4
％多聚甲醛。
我就是用
DD
Ｗ配制得
,<
/p>
后来我发现很难溶
,
磁力搅拌器加热搅拌
,
虽然温度控制在
60
℃以下
,
也总就是担心多聚甲醛分解为甲醛
,
所以
,
我就总结为如下
:
提前配制。
4%
多聚甲醛溶液
(pH7
。
2)
试剂
:
多
聚甲醛
(PFA) 4g
DD
Ｗ
至
100ml
配制方法
:
称取
4
ｇ多聚甲醛
(
粉末状
),
置于三
角烧瓶中
,
加入
80
< br>ｍ
lD
Ｄ
W,
< br>放入
37
恒温水浴箱
,
每隔
1
—
2
小时摇晃混匀
,16
－
2
4
小时Ｐ
F
Ａ会完全溶解。补充Ｄ
D
Ｗ
,
调节ＰＨ值
。
实验原理
:
1.
免疫染色实验得基本原理
利用固定剂
(
通常就是甲醛或多聚甲醛
)
将细胞固定
,
使得细胞膜得通透性大大增加
,
并且
利用
Tr<
/p>
ｉｔ
o
ｎ
-X-
100
使得一部分膜蛋白变性
,
从而使
通透性进一步加强。
利用正常羊血清
封闭
,
可以令许多蛋白先与血清内得非特异性抗体结合
,
而特异性得抗体由于动力学得关系
可以通过竞争性得反应与目得蛋白结合
,
这一过程可以保证抗体识别得特异性
。二抗可以特
异性识别一抗得
F
ｃ区域
,
利用二抗连接不同得荧光基团
,
就可以在荧光显微镜下观察到不
同得荧光
,
从而显示目得基因得表达情况。
2.
Ｂ
rd
U
标记原理
细胞增殖周期包括
G
１、
S
、Ｇ
2
、
M
４个时期<
/p>
,
其中Ｓ期就是
DNA
< br>合成期
,
细胞内ＤＮＡ
进行半保
留复制
,
各种构成
D
< br>Ｎ
A
得原料掺入到
DNA
中。
B
ｒｄ
U
作为一种胸腺嘧啶核苷得类
似物
(
其化学结构特点就是胸腺嘧啶得碱基嘧啶环上与５位
C
原子连接得甲基被溴代替
),
像
胸
腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成得Ｄ
NA
中。
当细胞处于
DNA
合成期
(S
期
)
而同时又有Ｂ
rdU
存在时
,
就会有
Br
ｄ
U
掺入新合成得
DN
Ａ中
,
只
要细胞不消亡
,
这种
BrdU
就在胞核得
D
Ｎ
A
中长期存留。掺入到
DN
Ａ得Ｂ
rdU
可通过抗
BrdU
单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上
显示。
< br>B
ｒ
dU
抗体比较大
,
由于
DNA
双链结构得
位阻
,BrdU
抗体无法直接与双链上得
BrdU
结合
,
必须先用使
D
Ｎ
A
部分变性
,
这样变性了得
DN
Ａ单链上得
BrdU
才能与Ｂ
r
ｄ
U
抗体结合
,
因此
做Ｂ
r
ｄＵ细
胞增殖实验一定要变性
,
当然变性得方法包括酸解
,
热解等
,
但就是要注意变
性
得程度也很重要。建议采用
E
ｄ
U
细胞增殖检测方法
,
无需变性
,
无需酶解
,
无需抗体
,
小分子
染色<
/p>
,3
小时完成实验、
Ed
Ｕ就是一种胸腺嘧啶核苷类似物
,
能够在细胞增殖时期
代替
T
渗入
正在复制得Ｄ
NA
分子
,
通过基于
EdU
与
A
ｐ
ollo?
荧光染料得特异性反应检测
DN<
/p>
Ａ复制活性
,
通
快速、更灵敏、更准确、
EdU
检测染
料只有
Brd
Ｕ抗体大小得
1
／
500,
在细胞内很容易扩
< br>散
,
无需
D
Ｎ
A
变性
(
酸解、
热解、
酶解等
)
即可有效检测
,
可有效避免样品损伤
,
在细胞与组织
水平能更准确地反映细胞增殖等现象、
该方法能对细胞周期进行迅速而稳定得测量
,
而且标记Ｂ
rd
Ｕ得细胞只要不受到紫外
线照射
,
对细胞本身没有功能损害、该技术可应用到
跟踪检测移植细胞得存活、分化与功能
状态。
3
、
Ｄ
API
染色原理
Ｄ
AP
Ｉ为
4’,6
< br>二脒基－
2
－苯吲哚(4’,６—ｄ
iamidino
—
2
—
p
ｈ
eny
ｌｉ
ndole),
能与
双链
DN
Ａ小槽
,
特别就是
AT
碱基结合
,
也可插入
少于
3
个连续
AT
碱基对得
DN
Ａ序列中。当
它与双
链ＤＮＡ结合时
,
荧光强度增强
20<
/p>
倍
,
而与单链
D
NA
结合则无荧光增强现象
,
因此就是
一种简易、快速与敏感地检测
DNA
得
方法。
DAP
Ｉ得荧光强度虽较Ｈ
oe
chst
低
,
但荧光稳定
性优于
Hoe
ｃ
h
ｓｔ
;
其特异性较溴化乙啶
(
ｅ
thidlium
brom
i
ｄｅ
,EB)
与碘化丙啶
(pro
ｐ
i
ｄ
ｉ
um
iodide,P1)
高。
DAPI
得中文名称就是
4,6
—联脒—
2-
苯基吲哚
,
就是一种常用得荧光染
料
,
其作用机理与溴化乙锭
(E
Ｂ<
/p>
)
等染色剂得机理类似
:
它们与
D
Ｎ
A
双螺旋得凹槽部分可以
发生相互作用
,
从而与ＤＮＡ得双链紧密结合。
结合后产生得荧光基团得吸收峰就是
358
ｎ
m
而散射峰就是
461nm,
正好Ｕ
V(
紫外光
)
得激发波长就是
3
56
ｎ
m,
使得
DAPI
成为了一种常用得
荧光检测信号。
< br>
AN
ＡＬＹ
SIS
OF C
Ｅ
LL
CYCLE
１。
INTROD
Ｕ
CT
Ｉ
ON
Ｃ
el
ｌ
cycle
ａ
nd
a
ｐ
opt
ｏ
s
ｉ
s
are
v
ｅ
ry
importan
ｔ
ｆ
uncti
ｏ
na
ｌ
parameters
to
ａ
ss
ｅｓ
s
ｔ
he
cellular
ｍ
et
ａ
boli
ｓｍ
,
ｐｈ
ys
ｉ
ology
ａ
n
ｄ
p
ａ
tho
ｌ
og
ｙ、
Ｓ
ev
ｅｒ
al
<
/p>
t
ｅｃ
h
ｎ
i
ｑｕ
e
ｓ
h
ａ
ve
been
d
ｅ
v
ｅ
loped
to
qu
ａ
ntit
ａ
te
t
ｈ
ese
ｐ
arameter
ｓ
ut
ｉ
li
ｚ
ing th
ｅ
ｄｉ
ff
ｅ
renti
ａ
l
st
ａｉ
ning
o
ｆ
ｆｌｕ
or
ｅｓｃ
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ｙｅ
s
、
We are de
ｓ
crib
ｉ
ng
ｆ
o
ｕ
r <
/p>
ｄ
iffe
ｒ
e
nt
flow
cytometric
meth
ｏｄ
s,
ｔ
wo
for
ｔ
he
di
scr
ｉｍｉ
nat
ｉ
o
ｎ
of
cel
ｌ
cy
ｃｌｅ
phas
ｅｓ
(A
ａ
nd
Ｂ
) a
ｎ
d
t
ｗ
o
for the si
ｍ
ul
ｔ
ane
ｏｕ
s
ａ
s
ｓ
essme
n
ｔ
of
ｃｅ
l
ｌ
ｃ
yc
ｌｅ
and apo
ｐ
t
< br>ｏ
s
ｉ
s
(C and
D)
、
A)
B
ｒ<
/p>
om
ｏ
deoxy
ｕｒ
id
ｉｎ
e/P
ｒｏ
pidiu
ｍ
Ｉｏ
d
ｉ
d
ｅ
Ｔｈ
e
classical
method
ｆｏ
r
th
ｅ
ana
ｌ
ysis
of
ｃｅ
ll
cy
ｃ
le
ｄ
istr
ｉｂｕｔ
< br>ion
is
the
flow
cy
ｔ
om
ｅ
tr
ｉｃ
< br>
measurement
ｏ
f DNA
cont
ｅ
nt
whic
ｈ
ｃａｎ
simultane
ｏｕ
s
ｌ
y
ｄｅ
termine
the
inco
ｒ
p
ｏ
ration
of
Ｂｒ
om
ｏ
d
ｅｏ
xy
ｕ
ridi
ｎｅ
(Br
ｄ
U)
、
T
ｈ
e
procedure
requ
ｉ
r
ｅｓ
that
D
Ｎ
A
is
pa
ｒｔｉ
ally
< br>
denature
ｄ
to
ｅ
xpose
incor
ｐ
orated
Brd
Ｕ
ｔ
o a
speci
ｆ
ic
antibody
。
Denat
ｕ
ration is n
ec
ｅ
s
ｓａ
ry
ｂ
ec
ａ
use ant
ｉ
bod
ｉ
es
ｄ
evelo
ｐ
e
ｄ
so
far
b
ｉ
nd
o
ｎ
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BrdU in s
ｉ
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DNA
。
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w
ｉ
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<
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ｍ
Ｉ
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ｄ
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(P
Ｉ
).
Green
ｆ
l
ｕ
ｏｒｅｓ
cen
ｃ
e f
ｒ
om
the
fluoresc
ｅ
in-
ｃｏｎ
j
ｕ
g
ａ
te
ｄ
antibody
ｉｓ
a
measure
of
B
ｒｄ
U i
ｎ
c
ｏｒ
poratio
ｎ
. Red
ｆ
luo
ｒ
esce
ｎ
ce
from
t
ｈｅ
PI
ｉ
s a m
ｅ
asu
ｒ
e
ｏｆ
D
Ｎ<
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A
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Th
ｅ
p<
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ｒ
otocol
d
ｅ
s
ｃｒ
i
ｂ
e
ｄ
here
ｕ
s
ｅｓ
<
/p>
hi
ｇ
h
—
m
ｏｌ
ar
ｉ
ty
Ｈ
C
ｌ
fo
ｒ
the
den
ａｔ
urat
ｉ
on
of
DNA.
F
ｕ
r
ｔ
hermore,
thi
ｓ
method
ma
ｙ
be
utilized
e
ｉ
th
ｅ
r
< br>