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研究生科技创新计划 项 目 申 请 书..

作者:高考题库网
来源:https://www.bjmy2z.cn/gaokao
2021-02-11 05:16
tags:

-

2021年2月11日发(作者:alimentary)


附件


2






南通大学研究生科技创新计划






























名:


















































别:



自然科学类√






哲学社会科学类□

















向√

















委托培养









自筹经费






















































































申请项目名称:蛋白激酶


A


底物

< p>
SSeCKS


在疼痛模型


的作用研究

















































医学院




































< br>学







制表













一、填写本表前,应先仔细阅读《 南通大学研究生科技创新


计划项目管理办法》等有关文件及本说明,务必实事求是填写。



二、


本表作为南通大学研究生科研创 新计划项目立项评审与


立项课题存档备查之用,



A4


纸打印,


一式三份报送研究生部。



三、填写本表栏目时,如需要可加附页。



四、


本表所有信息必须全部填写,


不存在的内 容一律填“无”。


项目名













项目类





















蛋白激酶


A


底物


SSeCKS


在疼痛模型作用的 研究




A.


哲学社会科学项目




B.

< p>
自然科学项目




100102



专业



名称



神经免疫



1986



08


电子



信箱



出生




入< /p>



年月




2007



09


申请



经费


0



5


万元





免疫学




起止



年限



重点



学科





































国家级





















研究方向


































出生年月



医学院





0513-850






51736


程纯









1963-09


年月











主要研究方向




神经免疫、肿瘤免疫、抗感染免疫



近三年在国内外核心刊物发表论文共


30


篇,出版专著(译著)





近三年获奖成果:




国家级



项,部省级





目前承担科研项目:国家级


1


项,部省级


1




近三年支配科研经费


15


万元,年均


5


万元



1


(含研究内容的创新点)






























(限


30 0


字)



蛋白激酶

A



protein kinase A, PKA)


在疼痛的发生和发展过程中有重要的生理和病理意义,但是


在底物水 平,对


PKA


复杂功能的探讨仍缺乏深入的研究。本课题在已有 工作的基础上,深入


分析


PKA


的底物


Src-suppressed C kinase substrate



SSeCKS


)在疼痛模型中的功能。课题首先< /p>


在整体水平,分析


SSeCKS


与疼痛病 理过程的时空相关性。接着在细胞水平,研究


SSeCKS


在< /p>


PKA


疼痛信号传导通路中的作用。再从蛋白质相互作用的角度, 进一步探讨


SSeCKS


及其相关


分子 在正常神经系统以及疼痛发展过程中复杂的蛋白质分子网络调控作用。课题从


PKA


底物


水平的新角度,研究


PKA

< p>
在疼痛模型中的复杂功能,为疼痛防治提供新的思路,具有一定的


理论和实 践意义。








主题词 (不超过


3


个)


蛋白激酶


A


,疼痛,


SSeCKS


①项目名称应简洁明了,字数限


25


个 汉字内;②申请额度:哲学社会科学项目不超过


2500


元,自 然科


学类项目不超过


5000


元。



2



一、立项 依据


(包括项目来源,研究意义,国内外研究现状、水平和发展趋势,选题的独


创性等,并附主要参考文献及出处)



疼痛是一 种与组织损伤或者潜在组织损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验以及保


护性或病理性 反应


[1]


。在疼痛的发生和发展过程中伴随着一系列的行为学 改变,如缩回反


射、逃避、保持损伤部位不动以及避免与相似的伤害性刺激接触等,以防 止伤害性刺激对


机体的进一步损害;同时伴随有中枢以及周围神经系统的疼痛相关因子的 分泌改变,最近


一些文章报道一些炎性介质如前列腺素


E2(p rostaglandin


E2)


,


5


-


羟色胺


(serotonin)


,


肾上腺



(epinephrine)


,



和神经生长因子(


nerve


growth


factor



,

< br>通过初级传入神经元中的蛋白激



A


protein kinase A, PKA)


,


蛋白激酶


C



protein kinase C , PKC)


,


或者细胞外信号调节激



(extracellular signal-regulated kinases, ERKs)



的活化,从而产生痛觉过敏反应



[2-4]




蛋白激酶


A



又称依赖于

< p>
cAMP


的蛋白激酶


A(cyclic-AMP dependent protein kinase A)




cAMP


的功能是作为一种细胞内第二信使传递细胞外的信号, 比如荷尔蒙和神经递质,到


达细胞内环境中。


PKA

< p>
是其主要靶蛋白,


PKA


是一种由四个亚基组成的 四聚体,


其中两个


是调节亚基


(reg ulatory


subunit


,


简 称


R


亚基


)


, 另两个是催化亚基


(


catalytic

subunit


,


简称


C




)


。当

< p>
cAMP



R


亚基结合后 ,


C


亚基分离,后磷酸化其底物。


cA MP/PKA


信号通路调


节很多的细胞进程,包括细胞的增殖、 分化、肌动蛋白骨架重构以及基因转录。在神经元


中,作为丝氨酸和苏氨酸激酶,


PKA


在生理和病理状态下,都可以被表达增加的

cAMP



化。很多研究已经证明


PKA


的活性在调节感受伤害性行为学中起着一定的作用


[5]


。但迄今


为止,在


PKA


底物水平,对


PKA


信号途径所介导的影响疼痛发生 和发展的机制仍缺乏深


入的研究。



SSeCKS



Src- suppressed C kinase substrate


SSeCKS


)为


PKC


的重要底 物,由于其基因


的转录被原癌基因


src


所抑制,其编码产物是


PKC


的底物,故命名为


SSeCKS



SSeCKS


全长


cDNA



5055bp


的开放阅读框,编码含


1684


个氨基酸残基 的多肽链,分子量为


280/290 kDa



在第


279-764


个氨基酸残基之间,有

< p>
4



PKC


的磷酸化位点 。


SSeCKS


人类同源蛋白质是


Gr avin


,分子量为


250 kDa


, 是重症肌无力患者体内的一种自身抗原,也是


PKA


锚定蛋白家


族中的成员(


A-kinase anchoring pro teins



AKAPs)


之一,故又 名为


AKAP12



SSeCKS


作为


细胞骨架蛋白,主要通过辅助信号转导相关分子在时间和空间上 的协调,而允许特定信号


转导和反馈控制。


SSeCKS


主要锚定于如


PKA



PKC


、钙调蛋白、细胞周期蛋白等重要信号


调节分子,从而 控制细胞分裂、分泌和迁移等运动


[6]


。在神经系统的研究中 ,主要发现


SSeCKS




1


)其人类同源物


Gravin


参与神经元的分化


[7]




2


)与脑发育有关


[8]


。(


3


)在感


觉神经元中有 表达


[9]


;(


4

)在星形胶质细胞中也有表达,并在血


-


脑屏障和血


-


视网膜屏障


的形成和功能维持中有重要功能


[10



11]


;(


5


)大鼠脊髓损伤后,在前、后角的神经元,白


质中的星形胶质细胞中的表达明显增加


[12]


。有关


SSeCKS


在疼痛发生发展过程中的意义还

< p>
缺乏系统、深入的研究。



Tatsuro


等人证明,


在活体,


鞘内注射缓激态引起热痛 觉过敏,


这种痛行为学可以被


PKC



PKA


的抑制剂所阻滞


[13]



PKA


的抑制剂能完全取消缓激态增强的异 硫氰酸丙烯基酯


(AITC, allyl isothiocyanate)


激发的电流,而且


PKA


的激活剂可以激活此电 流,表明


PKA


信号


通路在瞬时受体电 位通道


A1(transient receptor potential channel A1,TRPA1)


的疼痛致敏机制


中起着重 要的作用


[14]



在小鼠

< p>
DRG


神经元,


AKAP150

< br>是一个主要的


PKA


锚定蛋白,


参与了


PGE2/PKA


依赖的


TRP V1


瞬时受体电位香草醛亚家族


1


(< /p>


transient receptor potential vanilloid < /p>


1,TRPV1


)表达的调节。


Sand ra


等报道,


SSeCKS


表达在背根 神经节和脊髓后角,并且与


P



3 < /p>


质,降钙素基因相关肽,酸性磷酸酯酶等疼痛相关分子存在一定的共定位

< br>[9]



SSeCKS


是否


参与疼痛信号的传导?与疼痛传导的信号传导途径有什么关系?


< /p>


蛋白质之间相互作用的研究,是功能基因组的重要组成部分。


Wa ssler



[15]


证实

< p>
SSeCKS



β


1,4


-


半乳糖基转移酶



I



β


1,4 galactosyltransferase I



GalT -I



相互作用:


SSeCKS


有两个区域结



GalT-I


,调节


GalT-I


在高尔基体和细胞表面之间的转移 。


GalT-I


是目前发现唯一的既能在细

胞膜上发挥重要的细胞粘附作用、又能在高尔基体上参与糖链合成的糖基转移酶。本课题

组已证明,


GalT-I


在神经系统发育与再生,胶质细胞 活化与炎症反应中发挥重要作用


[16-18]



那么


SSeCKS


影响


Ga lT-I


的功能在疼痛发生和发展过程中的意义,是值得进一步探讨的。



最近,


有课题组通过酵母双杂交发现一种热休克蛋白



heat shock proteins



HSP) HspA12B


能与


SSeCKS


相互作用


[19]

< p>


HSP


是在细胞中丰富表达、种族进化中高度保 守与应激反应相关


的一组蛋白。


HSP70

是其中最大的一个家族,


HspA12


< br>HSP70s


的亚家族,有


HspA12A




HspA12B


这两个 成员。


HspA12B


能够调节内皮细胞的迁移和粘附


[19]


,而


SSeCKS

能抑制血管发


生和促进血脑屏障紧密连接的形成


[10]< /p>


。也有报道显示


SSeCKS


在亚融合状 态表达很强,在融


合状态表达较弱


[20]


HspA12B


的表达模式正好相反

[19]



HspA12B


在脑发 育中的表达模式与


SSeCKS


惊人一致


[8,19]


。那么,


HspA12B



SSeCKS


相互作用,在疼痛的发生和发展过程中又有< /p>


什么意义?



综上所述,作为

< p>
PKA


的重要底物,细胞骨架蛋白


SSeCKS< /p>


与神经系统的结构和功能关


系密切,但在疼痛模型中的作用和意义 还缺乏系统、深入的研究。本申请课题拟从疼痛的


发生和发展过程,深入研究

< p>
SSeCKS


及其相互作用分子在疼痛模型中的生理与病理意义。



参考文献



1



田明清,高崇荣



浅谈完善疼痛定义。疼痛,


2004 12


1



44-46


2.



Gold


MS,


Levine


J,


Correa


AM


(1998)


Modulation


of


TTX-R


Ina


by


PKC


and


PKA


and


their


role


in


PGE2-induced sensitization of rat sensory neurons in vitro. J Neurosci 18:10345



10355.


3. Khasar SG, Lin YH, Martin A, Dadgar J, McMahon T, Wang D, Hundle B, Aley KO, Isenberg W, McCarter


G


, Green PG, Hodge CW, Levine JD, Messing RO (1999) A novel nociceptor signaling pathway revealed in


protein kinase C _ mutant mice. Neuron 24:253



260.


4.


Aley


KO,


Martin


A,


McMahon


T,


Mok


J,


Levine


JD,


Messing


RO


(2001)


Nociceptor


sensitization


by


extracellular signal-regulated kinases. J Neurosci 21:6933



6939.


5.



Wu,


J.,


Su,


G.,


Ma,


L.,


Zhang,


X.,


Lei,


Y


.,


Lin,


Q.,


Nauta,


H.J.,


Li,


J.,


Fang,


L.,.The


role


of


c-AMP-dependent protein kinase in spinal cord and post synaptic dorsal column neurons in a rat model of


visceral pain. Neurochemistry international. 2007 50, 710-718.


6. Bu Y


, Gelman IH. v-Src-mediated down-regulation of SSeCKS metastasis suppressor gene promoter by the


recruitment of HDAC1 into a USF1-Sp1-Sp3 complex. J Biol Chem. 2007;282:26725-26739.


7.


Piontek


J,


Brandt


R.


Differential


and


regulated


binding


of


cAMP- dependent


protein


kinase


and


protein


kinase C isoenzymes to gravin in human model neurons: Evidence that gravin provides a dynamic platform


for the localization for kinases during neuronal development. J Biol Chem. 2003; 278:38970-9.


8. Chen L, Qin J, Cheng C, et al. Developmental regulation of SSeCKS expression in rat brain. J Mol Neurosci.


2007; 32:9-15.


9. Siegel SM, Grove BD, Carr PA. SSeCKS immunolabeling in rat primary sensory neurons. Brain Res. 2002;


926:126-36.


4


10.


Lee


SW,


Ki


WJ,


Choi


YK,


et


al.


SSeCKS


regulates


angiogenesis


and


tight


junction


formation


in


blood-brain barrier. Nat Med. 2003; 9:900-6.



11.


Choi


YK,


Kim


JH,


Kim


WJ,


et


al.


AKAP12


regulates


human


blood-retinal


barrier


formation


by


downregulation of hypoxia-inducible factor-1alpha. J Neurosci. 2007; 27:4472-81.


12.


Xiao


F,


Fei


M,


Cheng


C,


et


al.


Spatiotemporal


Patterns


of


SSeCKS


Expression


After


Rat


Spinal


Cord


Injury. Neurochem Res. 2008 Feb 29 :1735-1748


13.


Kohno, T.,


Wang, H., Amaya,


F.,


Brenner,


G


.J., Cheng, J.K., Ji, R.R., Woolf,


C.J.,


Bradykinin


enhances


AMPA and NMDA receptor activity in spinal cord dorsal horn neurons by activating multiple kinases to


produce pain hypersensitivity. J Neurosci. 2008 April 28(17): 4533-4540.


14. Wang, S.,Dai,Y., Fukuoka. T., Yamanaka, H., Kobayashi, K., Obata, K., Cui, X., Tominaga, M., Noguchi1


K.,.


Phospholipase


C


and


protein


kinase


A


mediate


bradykinin


sensitization


of


TRPA1:


a


molecular


mechanism of inflammatory pain. Brain. 2008 131,1241-1251.


15. Wassler MJ, Foote CI, Gelman IH, et al. Functional interaction between the SSeCKS scaffolding protein


and the cytoplasmic domain of beta1,4-galactosyltransferase. J Cell Sci. 2001;114:2291-300.


16.


Yan


M,


Xia


C,


Niu


S,


et


al.


The


Role


of


TNF-alpha


and


its


Receptors


in


the


Production


of


beta-1,4-galactosyltransferase


I


mRNA


by


Rat


Primary


Type-2


Astrocytes.


Cell


Mol


Neurobiol.


2008;


28:223-36.


17.


Yan


M,


Xia


C,


Niu


S,


et


al.


The


role


of


TNF-alpha


and


its


receptors


in


the


production


of


beta-1,4


galactosyltransferase I and V mRNAs by rat primary astrocytes.J Mol Neurosci. 2007; 33:155-62.


18.


Shen


A,


Yan


J,


Ding


F,


Gu


X,


Zhu


D,


Gu


J.


Overexpression


of


beta-1,4-galactosyltransferase


I


in


rat


Schwann cells promotes the growth of co-cultured dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 2003;342:159-62.


19. Rebecca J, Steagall AE, Rusi?


ol QA et al. HSPA12B is predominantly expressed in endothelial cells and


required for angiogenesis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2006; 26;2012-2018.


20. Grove BD, Bruchey AK. Intracellular distribution of gravin, a PKA and PKC binding protein, in vascular


endothelial cells. J Vasc Res. 2001; 38:163



175



5


二、研究目标、研究内容和拟解决的主要问题



2.1


研究目标:



2.1.1



明确

< br>SSeCKS



CCI


损伤,以 及疼痛发生、发展的时空相关性;



2.1.2



明确


SSeCKS

< br>与其相关分子的相互作用在疼痛发生和发展过程中的意义。



2.1.3



明确

< br>SSeCKS



PKA


介导的疼 痛传导通路中所起的作用。



2.2



研究内容:



2.2.1


在整体模型水平,


通过构建


CCI

< br>等疼痛模型,


分析


CCI


病程中


SSeCKS


的表达的时空


变化,讨论


SSeCKS


与疼痛生物学行为的可能相关性;在整体模型中干 预


SSeCKS


表达,


对比干预前后各 种指标,进一步探讨


SSeCKS


在其中可能发挥的作用。



2.2.2


在细胞培养水平,

< p>
研究


SSeCKS


的表达与在去除胞体的原代背根 神经节的刺激作用下


星形胶质细胞生物行为改变,以及合成和释放细胞因子之间的关系。



2.2.3


在分子水平,利用分子生 物学手段以及


SSeCKS


自身的生化结构,构建


SSeCKS



RNAi


片 断,以及


SSeCKS


全长表达质粒,分析

SSeCKS


影响星形胶质细胞生物学功能的


机制,以及与


PKA


信号途径之间的关系。



2.2.4


从蛋白质之间相互作用的角度,研究


GalT-I



HspA12B


等< /p>


SSeCKS


相关分子,通过与


SSeC KS


相互作用,在


CCI


等疼痛模型中 的作用,进一步研究


SSeCKS


及其相关分子在疼

< p>
痛发生发展过程中复杂的蛋白质分子网络调控作用。



2.3


拟解决的科学问题





阐明


SS eCKS


与疼痛的关系及其参与的分子机制,明确


SSeCKS


的表达在


CCI


等疼痛模


型中的作用。



6


三、课 题的研究思路与方法、技术路线、试验方案(含创新性)及其可行性分析



3.1


利用


CCI

< br>等疼痛模型,阐明


SSeCKS


时空表达与疼痛的发生发 展的相关性,以及这种


相关性与


PKA


功能之间的关系。



3.1.1



建立大鼠


CCI


等疼痛模型。运用


Real-time PCR


、原位杂交、


Western Blotting


、免疫


组织化学等方法,分析疼痛发生发展过程中

SSeCKS


的表达的时空变化;



3.1.2



运用免疫荧光双标技术等 分析


SSeCKS


的细胞定位及其与疼痛相关分子的关系;



3.1.3



应 用小干扰


RNA


技术整体干预


SSeC KS


表达,分别检测上述模型中


SSeCKS

< br>干预


前后相关损伤和疾病变化情况,星形胶质细胞参数改变情况,探讨

< p>
SSeCKS


在疼痛


发生发展过程中的作用。



3.2



在细胞 培养水平中,分析


SSeCKS


的表达与在去除胞体的背根神经 节的刺激下星形胶


质细胞生物学行为改变,以及合成和释放细胞因子等之间的关系,以及 这些关系与


PKA


功能之间的相关性。



3.2.1



刺激分离、


纯化的大鼠脊髓星形胶质细胞



< br>明确


SSeCKS


在刺激下的星形胶质细胞


中表达的改变,分析这些改变与细胞骨架改变以及炎症因子合成、释放等生物学行

为之间的关系。利用


PKA


的抑制剂和激动剂进行干预,分 析这些关系与


PKA


功能


的相关性;< /p>


干预


SSeCKS


表达对分化的影响。< /p>


分析这些变化和影响与


PKA


功能的相< /p>


关性。



3.3



在分子水平,利用分子生物学手段干预


SSeCKS

< p>
的表达,探讨


SSeCKS


影响上述细胞


生物学功能的作用机制和可能的信号途径。



3.3.1



利用分子生物学手段,


以及


SSeCKS

< br>自身的生化结构,


构建或合成


SSeCKS


不同全


长表达质粒、


RNAi


片断,干预星形胶质细胞中的表达。分析不同


SSeCKS


水 平对


星形胶质细胞在刺激下生物功能改变的影响。



3.3.2



干预

SSeCKS


在脊髓星形胶质细胞的表达,


联合不同类型< /p>


PKA


及其信号途径的抑制


剂和激动剂,


分析影响


SSeCKS


影响星形胶质细 胞功能的机制和可能存在的


PKA



其 它信号途径。



3.4


< p>
分析


SSeCKS


与其相关分子

< br>HSP70


等相互作用,在疼痛发生和发展过程中的意义。



3.3.3



应用蛋白质免疫共沉 淀、免疫荧光双标记和激光共聚焦分析方法,分析


SSeCKS



其相关分子


HSP70


等在上述疼痛 模型中不同时期时空表达的相关性。



3.3.4



分析

SSeCKS


与其相关分子


HSP70

等在脊髓星形胶质细胞受到各种刺激后的相互作


用情况。



3.3.5



利用分子生物学手段,干 预


SSeCKS


相关分子


HSP70< /p>


等表达,分析干预后对脊髓星


形胶质细胞生物学行为的影响,及与


SSeCKS


的相关性。



3.3.6



干预

SSeCKS


相关分子


HSP70


等在脊髓星形胶质细胞的表达,


分析其与


SSeCKS



互作用的上、下游关系,和可能的作用机制和信号途径。



3.5



根据以上结果 ,综合分析


SSeCKS


在疼痛发生发展过程中的意义。



3.6




技术路线





7

-


-


-


-


-


-


-


-



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