-
附件
2
:
南通大学研究生科技创新计划
项
目
申
请
书
申
请
者
姓
名:
申
请
类
别:
自然科学类√
哲学社会科学类□
攻
读
方
式
:
非
定
向√
定
向
□
委托培养
□
自筹经费
□
专
业
名
称
:
研
究
方
向
:
p>
申请项目名称:蛋白激酶
A
底物
SSeCKS
在疼痛模型
的作用研究
所
在
学
院
:
医学院
南
p>
通
大
学
科
学
技
术
处
南
通
大
< br>学
研
究
生
部
制表
填
表
说
明
一、填写本表前,应先仔细阅读《
南通大学研究生科技创新
计划项目管理办法》等有关文件及本说明,务必实事求是填写。
二、
本表作为南通大学研究生科研创
新计划项目立项评审与
立项课题存档备查之用,
用
A4
纸打印,
一式三份报送研究生部。
三、填写本表栏目时,如需要可加附页。
四、
本表所有信息必须全部填写,
不存在的内
容一律填“无”。
项目名
称
①
项
目
概
况
项目类
别
专
业
代
码
蛋白激酶
A
底物
SSeCKS
在疼痛模型作用的
研究
A.
哲学社会科学项目
□
B.
自然科学项目
√
100102
专业
名称
神经免疫
1986
.
08
电子
信箱
出生
硕
士
入<
/p>
学
年月
2007
.
09
申请
经费
0
.
5
万元
②
免疫学
起止
年限
重点
学科
年
月
至
年
月
国家级
□
省
级
□
研究方向
申
请
人
姓
名
所
在
院
系
姓
名
性
别
女
出生年月
医学院
联
系
0513-850
电
话
51736
程纯
性
别
男
1963-09
年月
指
导
教
师
主要研究方向
神经免疫、肿瘤免疫、抗感染免疫
近三年在国内外核心刊物发表论文共
30
篇,出版专著(译著)
部
近三年获奖成果:
国家级
项,部省级
项
目前承担科研项目:国家级
1
项,部省级
1
项
近三年支配科研经费
15
万元,年均
5
万元
1
(含研究内容的创新点)
项
目
主
要
研
究
内
容
及
技
术
指
标
(限
30
0
字)
蛋白激酶
A
(
protein kinase A, PKA)
p>
在疼痛的发生和发展过程中有重要的生理和病理意义,但是
在底物水
平,对
PKA
复杂功能的探讨仍缺乏深入的研究。本课题在已有
工作的基础上,深入
分析
PKA
的底物
Src-suppressed C kinase substrate
(
SSeCKS
)在疼痛模型中的功能。课题首先<
/p>
在整体水平,分析
SSeCKS
与疼痛病
理过程的时空相关性。接着在细胞水平,研究
SSeCKS
在<
/p>
PKA
疼痛信号传导通路中的作用。再从蛋白质相互作用的角度,
进一步探讨
SSeCKS
及其相关
分子
在正常神经系统以及疼痛发展过程中复杂的蛋白质分子网络调控作用。课题从
PKA
p>
底物
水平的新角度,研究
PKA
在疼痛模型中的复杂功能,为疼痛防治提供新的思路,具有一定的
理论和实
践意义。
主题词
(不超过
3
个)
蛋白激酶
A
,疼痛,
SSeCKS
①项目名称应简洁明了,字数限
25
个
汉字内;②申请额度:哲学社会科学项目不超过
2500
元,自
然科
学类项目不超过
5000
元。
p>
2
一、立项
依据
(包括项目来源,研究意义,国内外研究现状、水平和发展趋势,选题的独
创性等,并附主要参考文献及出处)
疼痛是一
种与组织损伤或者潜在组织损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验以及保
护性或病理性
反应
[1]
。在疼痛的发生和发展过程中伴随着一系列的行为学
改变,如缩回反
射、逃避、保持损伤部位不动以及避免与相似的伤害性刺激接触等,以防
止伤害性刺激对
机体的进一步损害;同时伴随有中枢以及周围神经系统的疼痛相关因子的
分泌改变,最近
一些文章报道一些炎性介质如前列腺素
E2(p
rostaglandin
E2)
,
5
-
羟色胺
(serotonin)
,
肾上腺
素
(epinephrine)
,
和神经生长因子(
nerve
growth
factor
)
,
< br>通过初级传入神经元中的蛋白激
酶
A
(
protein kinase A,
PKA)
,
蛋白激酶
C
(
protein kinase C ,
PKC)
,
或者细胞外信号调节激
酶
(extracellular signal-regulated
kinases, ERKs)
的活化,从而产生痛觉过敏反应
[2-4]
。
蛋白激酶
A
,
又称依赖于
cAMP
的蛋白激酶
A(cyclic-AMP
dependent protein kinase A)
,
cAMP
的功能是作为一种细胞内第二信使传递细胞外的信号,
比如荷尔蒙和神经递质,到
达细胞内环境中。
PKA
是其主要靶蛋白,
PKA
是一种由四个亚基组成的
四聚体,
其中两个
是调节亚基
(reg
ulatory
subunit
,
简
称
R
亚基
)
,
另两个是催化亚基
(
catalytic
subunit
,
简称
C
亚
基
)
。当
cAMP
与
R
亚基结合后
,
C
亚基分离,后磷酸化其底物。
cA
MP/PKA
信号通路调
节很多的细胞进程,包括细胞的增殖、
分化、肌动蛋白骨架重构以及基因转录。在神经元
中,作为丝氨酸和苏氨酸激酶,
PKA
在生理和病理状态下,都可以被表达增加的
cAMP
活
化。很多研究已经证明
PKA
的活性在调节感受伤害性行为学中起着一定的作用
[5]
。但迄今
为止,在
PKA
底物水平,对
PKA
信号途径所介导的影响疼痛发生
和发展的机制仍缺乏深
入的研究。
SSeCKS
(
Src-
suppressed C kinase substrate
,
SSeCKS
)为
PKC
的重要底
物,由于其基因
的转录被原癌基因
src
所抑制,其编码产物是
PKC
的底物,故命名为
SSeCKS
。
SSeCKS
全长
cDNA
有
5055bp
的开放阅读框,编码含
1684
个氨基酸残基
的多肽链,分子量为
280/290 kDa
。
在第
279-764
个氨基酸残基之间,有
4
个
PKC
的磷酸化位点
。
SSeCKS
人类同源蛋白质是
Gr
avin
,分子量为
250 kDa
,
是重症肌无力患者体内的一种自身抗原,也是
PKA
锚定蛋白家
族中的成员(
A-kinase anchoring pro
teins
,
AKAPs)
之一,故又
名为
AKAP12
。
SSeCKS
p>
作为
细胞骨架蛋白,主要通过辅助信号转导相关分子在时间和空间上
的协调,而允许特定信号
转导和反馈控制。
SSeCKS
主要锚定于如
PKA
、
PKC
、钙调蛋白、细胞周期蛋白等重要信号
调节分子,从而
控制细胞分裂、分泌和迁移等运动
[6]
。在神经系统的研究中
,主要发现
SSeCKS
:
(
1
)其人类同源物
Gravin
参与神经元的分化
[7]
;
(
2
)与脑发育有关
[8]
。(
3
)在感
觉神经元中有
表达
[9]
;(
4
)在星形胶质细胞中也有表达,并在血
-
脑屏障和血
-
视网膜屏障
的形成和功能维持中有重要功能
[10
,
11]
;(
5
)大鼠脊髓损伤后,在前、后角的神经元,白
质中的星形胶质细胞中的表达明显增加
[12]
。有关
SSeCKS
在疼痛发生发展过程中的意义还
缺乏系统、深入的研究。
Tatsuro
等人证明,
在活体,
鞘内注射缓激态引起热痛
觉过敏,
这种痛行为学可以被
PKC
和
PKA
的抑制剂所阻滞
[13]
。
PKA
的抑制剂能完全取消缓激态增强的异
硫氰酸丙烯基酯
(AITC, allyl isothiocyanate)
激发的电流,而且
PKA
的激活剂可以激活此电
流,表明
PKA
信号
通路在瞬时受体电
位通道
A1(transient receptor potential
channel A1,TRPA1)
的疼痛致敏机制
中起着重
要的作用
[14]
。
在小鼠
DRG
神经元,
AKAP150
< br>是一个主要的
PKA
锚定蛋白,
参与了
PGE2/PKA
依赖的
TRP
V1
瞬时受体电位香草醛亚家族
1
(<
/p>
transient receptor potential vanilloid <
/p>
1,TRPV1
)表达的调节。
Sand
ra
等报道,
SSeCKS
表达在背根
神经节和脊髓后角,并且与
P
物
3 <
/p>
质,降钙素基因相关肽,酸性磷酸酯酶等疼痛相关分子存在一定的共定位
< br>[9]
。
SSeCKS
是否
p>
参与疼痛信号的传导?与疼痛传导的信号传导途径有什么关系?
<
/p>
蛋白质之间相互作用的研究,是功能基因组的重要组成部分。
Wa
ssler
[15]
证实
SSeCKS
与
β
1,4
-
半乳糖基转移酶
I
(
β
1,4
galactosyltransferase I
,
GalT
-I
)
相互作用:
SSeCKS
有两个区域结
合
GalT-I
,调节
GalT-I
在高尔基体和细胞表面之间的转移
。
GalT-I
是目前发现唯一的既能在细
胞膜上发挥重要的细胞粘附作用、又能在高尔基体上参与糖链合成的糖基转移酶。本课题
组已证明,
GalT-I
在神经系统发育与再生,胶质细胞
活化与炎症反应中发挥重要作用
[16-18]
。
那么
SSeCKS
影响
Ga
lT-I
的功能在疼痛发生和发展过程中的意义,是值得进一步探讨的。
最近,
有课题组通过酵母双杂交发现一种热休克蛋白
(
heat shock proteins
,
HSP) HspA12B
能与
p>
SSeCKS
相互作用
[19]
。
HSP
是在细胞中丰富表达、种族进化中高度保
守与应激反应相关
的一组蛋白。
HSP70
是其中最大的一个家族,
HspA12
是
< br>HSP70s
的亚家族,有
HspA12A
和
HspA12B
这两个
成员。
HspA12B
能够调节内皮细胞的迁移和粘附
[19]
,而
SSeCKS
能抑制血管发
生和促进血脑屏障紧密连接的形成
[10]<
/p>
。也有报道显示
SSeCKS
在亚融合状
态表达很强,在融
合状态表达较弱
[20]
,
HspA12B
的表达模式正好相反
[19]
。
HspA12B
在脑发
育中的表达模式与
SSeCKS
惊人一致
[8,19]
。那么,
HspA12B
与
SSeCKS
相互作用,在疼痛的发生和发展过程中又有<
/p>
什么意义?
综上所述,作为
PKA
的重要底物,细胞骨架蛋白
SSeCKS<
/p>
与神经系统的结构和功能关
系密切,但在疼痛模型中的作用和意义
还缺乏系统、深入的研究。本申请课题拟从疼痛的
发生和发展过程,深入研究
SSeCKS
及其相互作用分子在疼痛模型中的生理与病理意义。
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SSeCKS
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Yan
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Role
of
TNF-alpha
and
its
Receptors
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beta-1,4-galactosyltransferase
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role
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and
its
receptors
in
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galactosyltransferase I and V mRNAs by
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–
175
5
二、研究目标、研究内容和拟解决的主要问题
2.1
研究目标:
2.1.1
明确
< br>SSeCKS
与
CCI
损伤,以
及疼痛发生、发展的时空相关性;
2.1.2
明确
SSeCKS
< br>与其相关分子的相互作用在疼痛发生和发展过程中的意义。
2.1.3
明确
< br>SSeCKS
在
PKA
介导的疼
痛传导通路中所起的作用。
2.2
研究内容:
2.2.1
在整体模型水平,
通过构建
CCI
< br>等疼痛模型,
分析
CCI
病程中
SSeCKS
的表达的时空
变化,讨论
SSeCKS
与疼痛生物学行为的可能相关性;在整体模型中干
预
SSeCKS
表达,
对比干预前后各
种指标,进一步探讨
SSeCKS
在其中可能发挥的作用。
p>
2.2.2
在细胞培养水平,
研究
SSeCKS
的表达与在去除胞体的原代背根
神经节的刺激作用下
星形胶质细胞生物行为改变,以及合成和释放细胞因子之间的关系。
2.2.3
在分子水平,利用分子生
物学手段以及
SSeCKS
自身的生化结构,构建
SSeCKS
的
RNAi
片
断,以及
SSeCKS
全长表达质粒,分析
SSeCKS
影响星形胶质细胞生物学功能的
机制,以及与
PKA
信号途径之间的关系。
2.2.4
从蛋白质之间相互作用的角度,研究
GalT-I
、
HspA12B
等<
/p>
SSeCKS
相关分子,通过与
SSeC
KS
相互作用,在
CCI
等疼痛模型中
的作用,进一步研究
SSeCKS
及其相关分子在疼
痛发生发展过程中复杂的蛋白质分子网络调控作用。
2.3
拟解决的科学问题
阐明
SS
eCKS
与疼痛的关系及其参与的分子机制,明确
SSeCKS
的表达在
CCI
等疼痛模
型中的作用。
6
三、课
题的研究思路与方法、技术路线、试验方案(含创新性)及其可行性分析
3.1
利用
CCI
< br>等疼痛模型,阐明
SSeCKS
时空表达与疼痛的发生发
展的相关性,以及这种
相关性与
PKA
功能之间的关系。
3.1.1
p>
建立大鼠
CCI
等疼痛模型。运用
Real-time
PCR
、原位杂交、
Western Blotting
、免疫
组织化学等方法,分析疼痛发生发展过程中
SSeCKS
的表达的时空变化;
3.1.2
运用免疫荧光双标技术等
分析
SSeCKS
的细胞定位及其与疼痛相关分子的关系;
p>
3.1.3
应
用小干扰
RNA
技术整体干预
SSeC
KS
表达,分别检测上述模型中
SSeCKS
< br>干预
前后相关损伤和疾病变化情况,星形胶质细胞参数改变情况,探讨
SSeCKS
在疼痛
发生发展过程中的作用。
p>
3.2
在细胞
培养水平中,分析
SSeCKS
的表达与在去除胞体的背根神经
节的刺激下星形胶
质细胞生物学行为改变,以及合成和释放细胞因子等之间的关系,以及
这些关系与
PKA
功能之间的相关性。
3.2.1
刺激分离、
纯化的大鼠脊髓星形胶质细胞
。
< br>明确
SSeCKS
在刺激下的星形胶质细胞
中表达的改变,分析这些改变与细胞骨架改变以及炎症因子合成、释放等生物学行
为之间的关系。利用
PKA
的抑制剂和激动剂进行干预,分
析这些关系与
PKA
功能
的相关性;<
/p>
干预
SSeCKS
表达对分化的影响。<
/p>
分析这些变化和影响与
PKA
功能的相<
/p>
关性。
3.3
在分子水平,利用分子生物学手段干预
SSeCKS
的表达,探讨
SSeCKS
影响上述细胞
生物学功能的作用机制和可能的信号途径。
3.3.1
利用分子生物学手段,
以及
SSeCKS
< br>自身的生化结构,
构建或合成
SSeCKS
不同全
长表达质粒、
RNAi
片断,干预星形胶质细胞中的表达。分析不同
SSeCKS
水
平对
星形胶质细胞在刺激下生物功能改变的影响。
3.3.2
干预
SSeCKS
在脊髓星形胶质细胞的表达,
联合不同类型<
/p>
PKA
及其信号途径的抑制
剂和激动剂,
分析影响
SSeCKS
影响星形胶质细
胞功能的机制和可能存在的
PKA
及
其
它信号途径。
3.4
分析
SSeCKS
与其相关分子
< br>HSP70
等相互作用,在疼痛发生和发展过程中的意义。
3.3.3
应用蛋白质免疫共沉
淀、免疫荧光双标记和激光共聚焦分析方法,分析
SSeCKS
与
其相关分子
HSP70
等在上述疼痛
模型中不同时期时空表达的相关性。
3.3.4
分析
SSeCKS
与其相关分子
HSP70
等在脊髓星形胶质细胞受到各种刺激后的相互作
用情况。
3.3.5
利用分子生物学手段,干
预
SSeCKS
相关分子
HSP70<
/p>
等表达,分析干预后对脊髓星
形胶质细胞生物学行为的影响,及与
SSeCKS
的相关性。
3.3.6
干预
SSeCKS
相关分子
HSP70
等在脊髓星形胶质细胞的表达,
分析其与
SSeCKS
相
互作用的上、下游关系,和可能的作用机制和信号途径。
3.5
根据以上结果
,综合分析
SSeCKS
在疼痛发生发展过程中的意义。
3.6
技术路线
7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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