-
Antioxidant responses to drought in
sunflower and sorghum seeding
方法
1
测定土壤及植物水状况
（
1
）按照
Barrs<
/p>
和
Weatherley
（
1962
）的方发测定叶片
RWC
< br>（相对含水量）
。在
DAP
（开
花后
的天数）分别为
22
，
24
，
26
和
28
时，每日
10
：
00-11
：
00
之间取样，每次取两片新近成熟的
叶片→称重→将样品浸入蒸馏水中，在室温下浸润
4h
→在
80
℃下
烘干
48
小时并在植物材料焦
化前称重
。
（
2
）计算叶片的
< br>WC
（自然含水量）
，其分母为叶片的鲜重。
（
3
）土壤
WC
的测定用传统的重量分析方法。在
DAP
为
22
，
24
，
26
和
28
时
16
：
00
从花盆的
中心取样→称湿重→
80
℃下烘干
48
小时。
Notice 1RWC
计算：
RWC
=
（
W
f
－<
/p>
W
d
）／（
W<
/p>
t
－
W
d
）×
100%
2WC
计算：
WC=
（
W
< br>f
－
W
d
）／
W
f
×
100%
W
f
：叶片鲜重；
W
d
：叶片干重；<
/p>
W
t
：叶片吸
水饱和时的重量。
2
酶粗提液的制备
< br>为了测定
CA
T
，
POD
和
SOD
，取叶片<
/p>
0.5g()
→于
6ml
，
50mM
冰冷的磷酸钠缓冲液（含
< br>0.2mMEDTA
，
1%
（<
/p>
w/v
）聚吡咯烷酮，
pH7.0
）
，冰浴研磨→匀浆用
4
层纱布过滤→以每分钟
15000g
，
4
℃，离心
20min
→取上清。
上清液可用来测量酶活性（
Zhang
和
Kirkham
，
1994
）
。
为了测定
AP<
/p>
，
DR
，
MR<
/p>
和
GR
，取叶片
0.7g()
→于
8ml
，
25mM
冰冷的磷酸钠缓冲液（含
0.2mMED
TA
，
1%
（
w/v
）聚吡咯烷酮，
pH7.8
）<
/p>
，冰浴研磨→过滤匀浆→以每分钟
18000g
< br>，
4
℃，
离心
< br>15min
→取上清。上清液可用来测量酶活性（
Cak
mak
，
Strbac
和
Marschner
，
1993
）
。
试剂：磷酸钠缓冲液（含<
/p>
0.2mMEDTA
，
1%
（
w/v
）聚吡咯烷酮，
p
H7.0
）
。
3
酶活性的测定
所有的分光光度分析都使用
Hitachi
U-2000
型分光光度计。
3.1
SOD
总活性的测定按照
Giannopolitis
和
Ries
（
1977
）的方法略作修改（
Chowdhury
和
Choudhuri
，
1985<
/p>
；
Zhang et al
。
，
1995
）
。
3ml
反应混合液中含
63
μ
M
的
NTB
，
1.3
μ
M
的核黄素，
13mM
的蛋氨酸，
0
.1mM
的
EDTA
，
50mM
的磷酸缓冲液（
pH7.8
< br>）和
20
μ
L
< br>酶液。核黄素应最
后添加。将盛有反应混合液的试管放置在两盏
< br>4000lux
荧光灯下，打开荧光灯，反应开始，照
光
10min
，
关闭荧光灯，
反应终止，
马上测定它在
560nm
处的吸光度。
不照光的反应体系在
560nm
处的吸光度作为对照，
并将之从
A
560
中减去。
不加酶液的反应体系颜色最深，<
/p>
说明
NTB
被还原
量最大。
NTB
的光还原量与
SOD
的活性呈反比。
SOD
酶活性采用抑制
NBT
光还原
50%
< br>为一个
酶活单位。
Notic
e
：不加酶液的反应体系，以缓冲液代替酶液，其
560nm<
/p>
处的吸光度作空白。
试剂：
63
μ
M
的
NTB
，
1.3
μ
M
的核黄素，
13mM
的蛋氨酸，
0.1mM
的
EDTA
，
50mM
的磷酸缓
冲液（
pH7.8
）
试剂：
NTB
，核黄素，蛋氨酸，
< br>EDTA
，磷酸缓冲液（
pH7.8
）
3.2CA
T
与愈创木酚
POD
活性按照
C
hance
和
Machly
的方法测定
（
1955
）
。对
CA
T
来说，其活
性可以根据反应
混合液
1min
内在
240nm
处的吸光度随着
H
2
O
2
的分解而降低程度来确定（
ε
=39.4M
－
1
cm
－
1
，
C
hance
和
Machly
，
1955
）
。反应混合液包含
< br>50mM
磷酸缓冲液（
pH7.0
）
，
15mMH
2
< br>O
2
，
0.1ml
酶液。加入酶液反应即开始。对
POD
来说，其活性
可以通过测定反应混合
液在
460nm
处的吸光度在
1min
内因愈创木酚的氧化作用而增加来确定（
ε
=26.6M
－
1
cm
－
1
，
Chance
和
Machly
，
1955
）
。反
应混合液包含
20mM
愈创木酚
50<
/p>
μ
l
，
10mM
磷酸缓冲（
pH7.0
）
2.83ml
，
0.1ml
酶液。加入
40mMH
2
O
2
20
μ
l
后反应开始。
试剂：
H<
/p>
2
O
2
，愈创木
酚
3.3AP
的活性可以根据反应混
合液在
290nm
处的吸光度在
1mi
n
内降低程度来确定（
ε
=2.8mM
－
1
cm
－<
/p>
1
，
Nakano
和
Aasda
，
1981
）
。反应混合液包含
0.5mMAsA,0.1m
MH
2
O
2,
0.1mMEDTA,50mM
磷酸钠缓冲液（
pH7.0
）
，
0.15ml
酶液。加入
H
2
O
2
后反应开始。该反应速率可以通过减去未加酶
液反应体系
的反应速率进行校正。
3.4GR
活
性可以通过检测反应混合液在
340nm
处的吸光度
1min
内因
NADPH
氧化而降低的程
－
1
－
1
度来确定（
ε
=6.2mM
cm
，
Cakmak et al.,
1993
）
。反应混合液包含
1mME
DTA
，
1mMGSSG
，
0.2mMNADPH
，
0.1M
磷酸钠缓冲液（
pH7.8
）
，
0.15ml
酶液。加入
GSSG<
/p>
后反应开始。
3.5DR
活性可以通过检测反应混合液在
265nm
处的吸光
度因
AsA
形成而引起的变化来确定
（
ε
－
1
－
1
=14mM
cm
）
。反应混合液体包含
2.5mMGSH
，
0.1mMEDTA
，
0.2mM
DAsA
，
50mM
磷酸钠
缓冲液
（
pH7.0
）<
/p>
，
0.2ml
酶液
（
Nakano
和
Asada
，
1981
；
Cak
mak et al.
，
1993
）<
/p>
。
反应时间为
1min
< br>。
加入
DAsA
后反应开始。通
过减去未加酶液的反应体系吸光度进行校正。
试剂：
GSSG
，
NADPH
，磷酸钠，
GSH
，
DAsA
< br>－
3.6MR
活性可以通过检测反应混合液在
340nm
处的吸光度在
30s
< br>内的改变来确定（
ε
=6.2mM
1
cm
－
1
）
。
反应混合液体积为
3ml
，
包含
0.1mMNADH
，
2.5mMAsA
，
50mM<
/p>
磷酸钠缓冲液
（
pH7.6
）
，
4
单位
AsA
氧化酶，
0.15ml
酶液（
Hossain
，
Nakano
和
Asada
，
1984
；
Cakmak et al.
，
1993
）
。加
入
AsA
后反应开始。通过减去未加
< br>AsA
氧化酶反应体系的吸光度进行校正。
3.7
酶的粗提液中蛋白质含量按
Bradfor
d
的方法的测定，以
BSA
作标准。<
/p>
试剂：
AsA
氧化酶，
BSA
4
抗坏血酸和谷胱甘肽的提取与分析
取
1g
叶片材料置于
< br>10ml5%
冷的偏磷酸中匀浆，
以备测量
AsA
，
DAsA
，
GSH
和
GSSG
时
使用。
匀浆液在
4
℃，
22000g
／
min
，离心
15min
。取上清，并用之分析抗坏血酸和谷胱甘肽。
4.1AsA
，
D
AsA
和总的抗坏血酸（
AsA+DAsA
）含量按
Law
，
Charles
和
Halliwell
（
1983
）的方
法测定。在测定总抗坏血酸含量时，
一般先用
DTT
将
DAsA
还原为
AsA
。
DAsA
含量通过总抗
坏血酸含量与
AsA
之差来计算。测定总抗坏血酸含量的反应混合液包括上清液
0.3m
l
，
150mm
磷酸缓冲液
0.78ml
（含
5mMEDTA
，
pH7.4
）
和
10mMDTT0.15ml
。
将反应液在室温下
放置
10min
，
然后加入
0.5%N-
乙基马来酰亚胺
0.15ml
除去过剩的
DTT
。检测
AsA
的反应体系与上述混合液
相似，只是多加
0.3mlH
2
O
，不加
DTT
和
N-
乙基马来酰亚胺。接着在以上两反应体系分别加入
以下试剂：
6
%TCA0.6ml
，
44%
正磷酸<
/p>
0.6ml
，
4%
α
,
α
′
-
双吡啶
（溶剂为
70%
乙醇）
0.6ml
，
0.3%
α
,
α
′
-
双吡啶（
w/v
）
。加入以上试剂以后。反应混合液后，颜色都有所增加。将反应混合液涡
漩混匀，
40
℃下温育
40
min
，然后测量其在
525nm
处的
吸光度。绘制
0-100
μ
gAsAm
l
－
1
的标准
曲线。
试剂：偏磷酸，
DTT
，
N-
乙基马来酰亚胺，正磷酸，
α
,
α
′
-
双吡啶，
α
,
α
′
-
双吡啶
4.2GSH
和
GSSG
含量根据
Griffith
（
1985
）
Smith
（
1985
）的方法测定。
1ml
上清液加入
0.5M
磷
酸缓冲液
1.5ml
中和（
pH7
.5
）
，随后加入
50
μ
l
的
H
2
O
。上述溶液用来测定总谷胱甘肽
（
GSH+GSSG
）的含量。另取
1ml
上清液，加入
0.5M
磷酸缓冲
液
1.5ml
中和（
pH7.5
）
，并加入
2-
乙烯
吡啶
50
μ
l
，
以掩盖
GSH
，
然后将试管中的溶液混匀，
直到形成乳浊液。
将试管于室温
下
温育
60min
。上述溶液用来测定
GSSG
的含量。
GSH
含量即是总谷胱甘肽含量与
GSSG
之差。
测
定
GSH
含
量
的
反
应
混
合
液
含
< br>0.2mMNADPH
，
100ml
磷
酸
缓
冲
液
(pH7.5)
，
5mMEDTA,
0.6mMDTNB
，
3
单位的
GR
。加入
0.1ml
上清液后反应开始。其反应速率可以通过
测量反应混合液在
4
12nm
处的吸光度
1min
内的变化
来进行检测。绘制
0-100
μ
gGS
Hml
－
1
的标
准曲线。
试剂：
2-
乙烯吡啶，
GR
5
测定脂质过氧化作用
一般通过硫代巴比妥酸反应测定的
MDA
量来确定脂
质过氧化作用的程度。
MDA
含量按照
Dhindsa
，
Plumb-Dhindsa
和
Thorpe
（
1981<
/p>
）方法测定。取
0.4g
叶片（
）加
6ml
的
1%TCA
搅匀。匀浆以
10000g/min
离心
10min
。取
< br>1ml
上清液加入
20%TCA4ml
< br>，其中包括
0.5%
硫代巴
比妥
酸。混合液在此
95
℃加热
30min
，在一冰盒中迅速冷却。试管以
10000g/min
离心
10min
，
然后
测定上清液在
532nm
处的吸光度，并从中减去其在
600nm
非特异性吸光度。
MDA
含量的
计算是通过其消光系数为
155mM
－
1
cm
－
1
来计算的（
Heath
和
Packer,1968
）
。
试剂：
TCA
，
硫代巴比妥酸
6
测定色素含量