-
Chip
步骤
组织裂解：
1.
新鲜组织。切成
1-3
mm
3
小块。
2.
转移组织到
50ML
试管里。加入
10 ml of
1
X
PBS.
3.
加
甲醛
至终浓度为
1%
。室温下转动
15
—
20mins
。
（
10ul
）
4.
加
2.5 M
Glycine
至终浓度为
0.125 M(
< br>终止交联
)
。
4°
C
下转动
10mins
。<
/p>
（
0.5ml
）
5.
100 g,
4°
C
离心样本
5mins
。
6.
弃上清，取沉淀。用
45 ml
冰冻
1
X
PBS
和
25 ml
冰冻
1X
PBS
各洗一次。离心弃上清。
7.
再加入
2 ml
冰冻
1X
PBS
。匀浆机裂解组织。
1000
rpm
，
4°
C
，离心
5
min
。弃上清。
8.
细胞裂解液重悬细胞。加入蛋白酶抑制剂
PMSF (10
ul per ml), aprotinin (1 ul per ml) and
leupeptin (1 ul per ml).
冰上孵育
10-15mins
9.
5,000 rpm
，
4°
C
离心
5
分钟。取沉淀
10.
细胞核裂解液重悬细胞加入（
8
）中的蛋白酶抑制剂。冰上孵育
10
-20mins
。
11.
接下来就进去超声过程了。<
/p>
（接下来第一天的
5
）
< br>
第一天
1.
细胞中加入
1%
的甲醛，
8ml
的培养液加入
216 ul
的甲醛，
37
度十分钟。
2.
配制含有蛋白酶抑制剂的
PBS 20 ml
< br>和含有蛋白酶抑制剂的
SDS
溶液
1ml
3.
将细胞拿出来，迅速
的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的
PBS
洗两遍。
胰酶
消化
20
秒，加入含蛋白酶抑制剂
的
PBS 1ml
。用细胞刮刀把细胞刮下，收集到
1.5ml
的
离心管里面。
4.
4
度
200
0rpm
离心
10min
，弃上清液，
加入
200ul
含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。吹打
重悬细胞，冰上孵育１０分钟。
5.
超声切割ＤＮＡ，总切割时间<
/p>
４
min30sec
，超声
10sec,
间隙
10sec
。
6.
4
度
130
00rpm
离心
10min
，转移上清
液到一个新的
2ml
的离心管，弃沉淀。
7.
稀释超声后的上清液到
10X
的
CHIP
稀释液，
200ul
的上清液加入
1.
8ml
的
CHIP
稀释液，
达到最终体积
2ml
。
8.
为去除非特异性，加入
75ul
的
Salmon Sperm
DNA/Protein A Agarose-50% Slurry
，
4
度旋
转
30
分钟
。
9.
1000rpm
离心
3min
沉淀
Salmo
n Sperm DNA/Protein A Agarose-50%
Slurry
，收集上清液。
10.
上清液加入
< br>1
抗，
4
度振荡过夜。
（
5
—
10
大概一个小时）
第二天
（
1
—
8
大概
两个半小时）
1.
加
60ul
的
Salmon
Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry
，
沉淀抗体
/
抗原复合物，
4
度
旋转
一小时
。
2.
1000rpm 4
度
3min
收集沉底，移除上清液，开始洗脱过程。
3.
低盐免疫复合物洗脱液，旋转<
/p>
5min
，
1000rpm
离心
3min
收集沉淀
4.
高盐免疫复合物洗脱液，旋转<
/p>
5min
，
1000rpm
离心
3min
收集沉淀
5.
Licl
免疫复合物洗脱液，旋转
5min
，
1000rpm
离心
3min
收集沉淀
6.
TE
Buffer
，旋转
5min
，
1000rpm
离心
3min
收集沉淀，两次
7.
现在得到的是
protein
A/antibody/histone/DNA
compl
ex
，新制备
elution
buffer
(1%SDS,
0.1M
NaHCO3)
。加
250ul
elution
buffer
到沉淀
，混匀后室温旋转
15min
。
100
0rpm
离
心
3min
沉淀，移上清液到新的离心管，重复上面的过程，最后上清液体积大约
500u
l
。
8.
加入
20ul
的
5M
的
nacl
反转交联，
65
度过夜。
第三天
（大概
3
个小时）
-
-
-
-
-
-
-
-
-
上一篇：员工转正批复语怎么写
下一篇：单位同意员工辞职批复范文