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染色质免疫沉淀（
ChIP
）实验指南及技术总
结
ChIP
是一项比较流行的研究转录因子（
transcription factor, TF
）与启动
子（
promoter
）
相互结合的实
验技术。由于
ChIP
采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所
以能比较真实的
反映细胞内
TF
与
Promoter
的结合情况。这个优势是
EMSA
这个体外研究核酸与蛋白相互
结合的实验方法所不能比
拟的。
当用甲醛处理时，
相互靠近的蛋白与蛋白，
蛋白与核酸
（
DNA
或
RNA
）之间会产生共价键。细胞内，当
T
F
与
Promoter
相互结合（生物
意义上的结合）
时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，
这
个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价
键。
一般
ChIP
的流程是：
甲
醛处理细胞——收集细胞，
超声破碎——加入目的蛋白的抗体，
与靶蛋白
-DNA
复合物相互结合——加入
Protein A
，
结合抗体
-
靶蛋白
-DNA
复合物，
并沉淀
——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，
得到富集的靶蛋白
-DNA
复合物——解交联，纯化富集的
DNA-
片断——
PCR
< br>分析。
在
PCR
分析这一块，比较传统的做法是半定量－
PCR
。但
是现在随着荧光定量
PCR
的
普及，大
家也越来越倾向于
Q
－
PCR
了。此外还有一些由
ChIP
衍生出来的方法。
例如
RIP
（其实就是用
ChIP
的方法研究细胞内蛋白与
RNA
的相互结合
，具体方法和
ChIP
差不多，
只是实
验过程中要注意防止
RNase
，
最后
分析的时候需要先将
RNA
逆转录成为
cDNA
）
；
还
有
ChIP-chip
（其实就是
C
hIP
富集得到的
DNA-
片段，拿去
做芯片分析，做法在
ChIP
的基
础上
有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）
。
第一天：
（一）
、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1
、
取出
1<
/p>
平皿细胞
（
10cm
平皿）
，
加入
243ul 37<
/p>
％甲醛，
使得甲醛的终浓度为
1
％。
（培
养基共有
9m
l
）
2
、<
/p>
37
摄氏度孵育
10min
。
3
、终止交联：加甘氨
酸至终浓度为
0.125M
。
450ul 2.5M
甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置
5min
即可。
4
、吸尽培养基，用冰冷的
PBS
清洗细胞
2
次。
5
、
细胞刮刀收集细胞于
15ml
离心管中
（
PBS
依次为
5ml
，
3ml
和
3ml
）
。
预冷后
2000rpm
5min
收集细胞。
6
、倒去上清。按照细胞量，加入
SDS Lysis
Buffer
。使得细胞终浓度为每
200ul
含
2
×
10
< br>6
个细胞。这样每
100ul
溶
液含
1
×
10
6
个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设
MCF7
长满板为
5
×
10
6
个细胞。本次
细胞长得约为
80
％。即为
4
×
10
6
个细胞。因<
/p>
此每管加入
400ul SDS Lysis
Buffer
。
将
< br>2
管混在一起，共
800ul
。
7
、超声破碎：
VCX750
，
25
％功率，
4.5S
冲击，
9S
间隙。共
14
次。
（二）
、除杂及抗体哺育。
8
、超声破碎结束后，
10
，
000g 4
度离心
10min
。去除不溶物质。
留取
300ul
做实验，其余保存于－
80
度。
300ul
中，
100ul
加抗体做为实验组；
100ul
不加抗体做为对照组；
100ul
加入
4ul 5M NaCl
（
NaCl
终浓度为
0.2M
）
< br>，
65
度处理
4h
解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9
、在
100ul
的超声破碎产物中，加入
900ul ChIP Dilution Buffer
和
20ul
的
50
×<
/p>
PIC
。
再各加入
60ul Protein A
Agarose/Salmon Sperm DNA
。
4
度颠转混匀
1h
。
10
、
1h
后
，在
4
度静置
10min
沉淀，
700rpm
离心
1
min
。
11
、取上清。各留取
20ul
做为
in
put
。一管中加入
1ul
抗体，另
一管中则不加抗体。
4
度颠转过夜。
（三）
、检验超声破碎的效果。
取
100ul
超声破碎后产物，加入
4ul 5M NaCl
，
65
度处理
4h
解交联。分出一半用酚
< br>/
氯
仿抽提。电泳检测超声效果。
第二天：
（一）
、免疫复合物的沉淀及清洗。
12
、孵育过夜后，每管中加入
60u
l Protein A Agarose/Salmon Sperm
DNA
。
4
度颠转
2h
。
13
、
4
度静置
10min
后，
700rpm
离心
1min
。除去上清。
14
、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在
4
度颠转
10min
，
4
度静置
10min
< br>沉淀，
700rpm
离心
1mi
n
，除去上清。
洗涤溶液：
a. low salt wash
buffer
—
-one wash
b. high salt wash
buffer
—–
one wash
c. LiCl wash
buffer
——
one wash
d. TE buffer
——
two
wash
15
、
清洗完毕后，
开始洗脱。
洗脱液的配方：
100ul 10
％
SDS
，
100ul 1M NaHCO3
，
800ul
ddH2O
，共
1ml
。
每管加入<
/p>
250ul
洗脱
buffer
，室温下颠转
15min
，静置离心后，收集上清
。重复洗涤一
次。最终的洗脱液为每管
500ul
。
16
、解交联：每管中加入
20ul
5M NaCl
（
NaCl
终浓度为<
/p>
0.2M
）
。
混匀，
65
度解交联过夜。
第三天：
（一）
、
DNA
样品的回收
17
、解交联结束后，每管加入
1ul
RNaseA
（
MBI
）
，
37
度孵育
1h
。
18
、每管加入
10ul 0.5M
EDTA
，
20ul 1M
（
PH
6.5
）
，
2ul 10mg/ml
蛋白酶
K
。
45
度处理
2h
。
19
、
DNA-
片段的回收―――
omega
胶回收试剂盒。最终的样品溶于
100ul
ddH2O
。
（二）
、
PCR
分析
二、技术总结
（一）
、关于细胞
< br>细胞的生长状态要好。
因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络
，
也
很有可能影响你所研究的
TF
与其靶
Promoter
的结合。
一般细胞长到
75
％
－
80
％比较好。
（二）
、关于抗体！
抗体是实验成败的致命因素之一！
必须是
IP
级别的抗体，
另外如果经济条件许可的话，
尽量
买大厂的抗体。不推荐国产抗体和
santa cruz
的抗体
，即使是
IP
级别的。
单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。
两种抗体各有利弊。
单抗特异性强，背景低。
但是
单抗有一个致命的弱点，就是
识别位点单一，而在
ChIP
甲醛交联的过程中，很有可能该位
点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，
导致单抗不能识别靶蛋白。
多抗虽然没有这个问题，
但
是多抗特异
性较差，背景可能会偏高。
一般而言，如果没有十足把握（单
抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域）
，选择
多抗比较稳
妥一些。
（三）
、关于交联与超声破碎！
这一块的确是
ChIP
实验中比较难把握的
部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，
交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因
组打碎成小片段。
交联不充分，
只有
一部分靶蛋白与其
Promoter
相结合，
< br>富集得到的
Promoter
的量不高，
实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，
对超声破碎造成障碍。
另外也会增
加背景。
一般来讲，
按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，
交联的条
件也不
一样。例如：
NIH
－
3T3
的交联条件是室温（
25
摄氏度）下
15min
，
1<
/p>
％的甲醛浓度，而别
的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条
件，
机器不一样，条件也不一样。当然如果你
有
bioruptor
这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。
一般，理想的超声破碎得到的片段大小是
200bp
－
1000bp
。但是
200bp
－
2000bp
的范围
也是可以接受的。
（四）
、关于操作
< br>希望尽可能的保持低温（
4
度）
。
沉淀的时候可以先在
4
度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（
500rpm
等）离
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